L-色氨酸

 

中文名称     L-色氨酸

中文同名     L-氨基吲哚丙酸;L-胰化蛋白氨基酸

英文名称     L-Tryptophan

化学式        C11H12N2O2

分子量        204.23

CAS编号    73-22-3

质检信息

质检项目       指标值

含量,％         ≥99%

PSA：          79.11000

LOGP：       1.82260

比旋   31.5  (c=1, H2O 24 C) 

沸点 342.72°C (rough estimate) 

密度 1.1754 (rough estimate) 

折射率 31 ° (C=1, H2O)ChemicalBook

化学特性

1.L-色氨酸为白色结晶性粉末。 无臭、味微苦， 在水中微溶（1.14%, 25℃), 难溶于乙醇。 可溶于稀酸或稀碱。

产品用途

1.氨基酸类药。 用于氨基酸输液。 常与铁剂、维生素等合用， 与VB6合用改善抑郁症， 防治粗皮病； 作为失眠镇静剂配合L-多巴用于治疗帕金森氏病。对实验动物有致癌性； 有恶心、厌食、哮睡等不良反应。 忌与单胺氧化酶抑制剂合用。

2.营养增补剂。 蛋清蛋白、鱼肉、玉米粉等所含色氨酸为限制氨基酸，大米等谷物中含量较少。可与赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸合用于强化氨基酸。按0.02%的色氨酸和0.1%的赖氨酸添加于玉米制品，可显著提高蛋白质效价。

3.L-色氨酸用于生化研究，医药上用作镇静剂。

4.改善营养、增强体质。

5.在色氨酸取代的Sephadex? 以及Sepharose?中的血清素与褪黑素的前体，用于改进的纤维素酶色谱分离；作为血清蛋白等速电泳法中的间隔片，满足各种各样微生物的生长要求

 

储藏措施

1.储存于阴凉、通风的库房。

2.应与氧化剂、食用化学品分开存放，切忌混储。

3.保持容器密封。      

4.远离火种、热源，防止阳光直射。

5.库房必须安装避雷设备。

6.排风系统应设有导除静电的接地装置。

7.采用防爆型照明、通风设置。

8.禁止使用易产生火花的设备和工具。

9.储区应备有泄漏应急处理设备和合适的收容材料。

10.防止粉尘和气溶胶生成。

急救措施 

【食入】摄入不可能。但是，如果摄入，获得紧急医疗照顾。

【吸入】如果克服被曝光，将受害人转移到空气新鲜处。给予吸氧或人工呼吸。获得紧急医疗照顾。迅速采取行动是至关重要的。

【皮肤】立即脱去污染的衣着。彻底清洗皮肤，用温和的肥皂/水。W /温水冲洗15分钟。如果是粘的，首先使用无水清洁。寻求医疗照顾，如果不良影响或刺激。

【眼睛】眼睛接触的情况下，立即用清水冲洗20-30分钟。经常收回眼皮。获得紧急医疗照顾。

生产方法 

以DL-色氨酸为原料，冷却状态下加入氯乙酸酐反应，经硫酸酸化后在冰水中研磨，过滤后水中重结晶，最后用胰羧肽酶处理，除去D-型，乙酸酸化、乙醇重结晶精制而得。

合成法 由合成法制得DL-色氨酸后，再经旋光拆开法制得。 由干酪素经胰酶分解而得。

L-色氨酸的制备可采用前体添加法生产， 以葡萄糖为碳源和能源， 添加前体邻氨基苯甲酸或吲哚进行培养， 将前体转化为L-氨基酸； 其二可采用酶法生产； 其三可采用化学合成法

其四可采用蛋白质水解法等。 下面详细介绍血纤蛋白酶水解法生产L-色氨酸。 工艺过程 血纤蛋白[蛋白酶、甲苯、氯仿]→[45℃, 酶水解]水解滤液[多孔H型树脂]→吸附[0.3mol/L氨水]→[洗脱]洗脱液[浓缩、结晶]→[冰箱中，24h]L-色氨酸粗品[65%乙醇重结晶]→L-色氨酸成品 酶水解 首先将血纤蛋白25kg, 加蒸馏水37.5kg。 加热使其变性， 甩干搓散后投入水解罐中， 加蒸馏水40-45L， 搅拌， 加热至45℃, 然后按序加入一定量的蛋白酶或指定物质， 保温45℃， 并控制好溶液pH值， 水解时间， 以求使蛋白完全水解， 而提高氨基酸收率。 先加入25g 3942 中性蛋白酶及175g 1398 中性蛋白酶， 甲苯和氯仿各2590ml, 每间隔半小时搅拌10min， 用Ca(OH)2悬浮液调控溶液pH值7.0-7.2, 48h后再加入175g 166酶制剂， 水解8h， 再加肾匀浆（内含氯化锰40g), 调控pH值7.5-8.0， 维持40h。 然后再加NaHSO3 110g, 以12mol/L的H2SO4调pH值5.0, 保温80℃ 20min， 最后过滤， 其滤渣用水洗涤2次， 洗液与滤液合并得水解液。 吸附洗脱 将水解液置于冰箱中， 保持0℃， 静置24h, 过滤除去沉降物， 取滤液以等体积水稀释， 让其通过装有多孔型阳离子交换树脂柱， 水解液中的氨基酸被吸附， 检查流出液当有色氨酸反应时停止上柱， 先用水洗柱， 再用0.3mol/L的氨水洗脱，收集洗脱液，至流出的洗脱液pH=12或检查无色氨酸时停止洗脱。 浓缩、结晶 将洗脱液减压浓缩至有结晶析出时， 冷却降温至0℃， 静置24h, 过滤取结晶， 用65%与95%乙醇先后洗涤结晶， 得色氨酸粗品。 母液再调pH至6.0, 又有结晶析出， 静置24h， 过滤取结晶， 同上述方法洗脱结晶， 合并两次粗品， 60℃真空干燥色氨酸粗品。 重结晶精制 将上述粗品用65%乙醇溶液重结晶2次， 并用95%乙醇液洗涤1次， 真空干燥8h， 得L-色氨酸成品。

一种L-色氨酸的发酵工艺的制作方法

L-色氨酸的分子式为C11H12O2N2，分子量为204.21，含氮13.72％。L-色氨酸是含有吲哚基的中性芳香族氨基酸，呈绢丝光泽、六角片状自色晶体，无臭，有甜味水中溶解度1.14g/L(25℃)溶于稀酸或稀碱，在碱液中较稳定，强酸中分解，微溶于乙醇，不溶于氯仿、乙醚。L-色氨酸是人体和动物生命活动中八种必需的氨基酸之一，对人和动物的生长发育、新陈代谢起着重要的作用，被称为第二必需氨基酸，它是继蛋氨酸和赖氨酸之后的第三大饲料添加氨基酸，广泛应用于医药、食品和饲料行业。

近年来，随着国内饲料工业的发展和L-色氨酸及其代谢产物研究的深入，尤其是随着我国老龄化程度不断加重，L-色氨酸在医药行业上的用途也不断扩大。目前，L-色氨酸逐渐成为一种国际市场发展潜力巨大、国内市场需求较大的产品。

目前，L-色氨酸的生产方法主要有4种：(1)蛋白质水解法：主要从含有相对丰富的L-色氨酸的废蚕丝、毛发和血粉等蛋白质原料通过酶水解或碱水解法来提取L-色氨酸。蛋白质水解法工艺复杂，生产周期长，产品成分复杂，现在使用较少。(2)化学合成法：化学合成主要以苯阱为原料或者以吲哚为原料合成，合成之后为DL-色氨酸，在经过拆分得到L-色氨酸。这种方法原料成本高，工艺复杂，工业推广差。(3)酶促转换法：利用微生物产生的L-色氨酸合成酶系转化前体合成L-色氨酸的方法。此法L-色氨酸合成酶受吲哚影响较严重，底物L-丝氨酸价格较高，吲哚水溶性较差，转化率不高。(4)发酵法：是指利用L-色氨酸高产菌种，采用葡萄糖等廉价碳源做原料，控制合适的发酵条件，从而获得L-色氨酸产品的一种方法。发酵法已经成为当前工业生产L-色氨酸最重要的方法。申请人之前的专利技术“一种工业化发酵高产L-色氨酸的方法”采用两种菌株混合发酵的方式，产酸率较单一菌株提高，但是存在培养工艺复杂、参数难以控制等缺陷。

技术实现要素：

本发明需要解决的实际技术问题是，克服现有技术的不足之处，提供了一种L-色氨酸的发酵工艺。

本发明的目的是通过下述技术方案实现的，

一种L-色氨酸的发酵工艺，其包括如下步骤：步骤1)制备L-色氨酸发酵液，步骤2)菌株二次处理，步骤3)合并提取L-色氨酸。

具体地，所述发酵工艺包括如下步骤：

步骤1)制备L-色氨酸发酵液：将产L-色氨酸的大肠杆菌培养至浓度为1×107cfu/mL的种子液，然后按照6-8％(v/v)接种量接种到发酵培养基中，控制发酵温度36℃，溶氧控制20％，罐压为0.05MPa，并通过流加浓度为100g/L的葡萄糖溶液将残糖控制在不低于1.0％，通过流加氨水控制在pH为6.8-7；发酵至30h停止，得到L-色氨酸发酵液；

步骤2)菌株二次处理：利用高速碟片分离机离心处理L-色氨酸发酵液，收集上层料液和湿菌体分离；往湿菌体中添加1-2wt％电气石粉，100rpm搅拌10-15min，然后停止搅拌，加热至53-55℃，保温1-2min，自然冷却至室温，然后添加到三倍重量的透析培养基中，培养温度36℃，100rpm搅拌培养4-6h，无机陶瓷膜过滤收集菌体和滤液；

步骤3)合并提取L-色氨酸：将步骤2)所得上层料液和滤液合并，用于提取L-色氨酸。

优选地，

所述发酵培养基组分为：葡萄糖20g/L、玉米浆10g/L、硫酸铵5g/L、磷酸氢二钾2g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸镁1.5g/L、柠檬酸1.5g/L、硫酸亚铁70mg/L、硫酸钠20mg/L、硫酸锰7mg/L、硫酸锌7mg/L、氯化钴6mg/L、硫酸铜0.9mg/L。

优选地，

所述透析培养基为(质量百分比)：磷酸二氢钾1.0％，磷酸氢二钾1.0％，硫酸铵0.5％，聚乙二醇0.06％，硫酸亚铁0.01％，硫酸锰0.01％，硫酸镁0.01％。

优选地，

所述无机陶瓷膜的膜孔径50nm。

优选地，

所述高速碟片机的离心转速为3000rpm，离心时间为5min。

本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：

本发明针对发酵工序的进行改进，避免L-色氨酸浓度积累到引起反馈抑制，针对发酵后的废弃菌体进行二次产酸处理，增加了细胞膜的通透性，提高了菌株的产酸能力，发酵周期大大延长；

适当时间和温度的热处理可以提高菌株的产酸能力以及细胞膜通透性，配合透析培养基，使得L-色氨酸的产率大大提高；

电气石能够自动释放负离子，负离子具有较强的氧化性，还持续发生直流静电，释放矿物质和微量元素，对菌株繁殖起促进作用；本发明采用透析培养基对菌株进行培养，能改变细胞的生物膜结构，促进物质的利用和转运，同时使L-色氨酸积累引起的反馈抑制调节大大降低，产酸效率提高，而且后续的残糖少，不会造成菌株黏着絮凝成团，有利用后续的膜过滤分离。

说明书附图

图1：电气石粉添加量对L-色氨酸含量的影响。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本发明进行更加清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1

一种L-色氨酸的发酵工艺，其包括如下步骤：

将大肠杆菌CCTCC M 2011316培养至浓度为1×107cfu/mL的种子液，然后按照6％(v/v)接种量接种到发酵培养基(葡萄糖20g/L、玉米浆10g/L、硫酸铵5g/L、磷酸氢二钾2g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸镁1.5g/L、柠檬酸1.5g/L、硫酸亚铁70mg/L、硫酸钠20mg/L、硫酸锰7mg/L、硫酸锌7mg/L、氯化钴6mg/L、硫酸铜0.9mg/L)中，控制发酵温度36℃，溶氧控制20％，罐压0.05MPa，并通过流加浓度为100g/L的葡萄糖溶液将残糖控制在不低于1.0％，通过流加氨水控制在pH为6.8；发酵至30h停止，得到L-色氨酸发酵液；

利用高速碟片分离机离心处理L-色氨酸发酵液，收集上层料液和湿菌体分离；高速碟片机的转速为3000rpm，时间为5min；往湿菌体中添加1.5wt％电气石粉，100rpm搅拌15min，然后停止搅拌，加热至53℃，保温2min，自然冷却至室温，然后添加到三倍重量的透析培养基中，培养温度36℃，100rpm搅拌培养6h，无机陶瓷膜过滤收集菌体和滤液；所述透析培养基为(质量百分比)：磷酸二氢钾1.0％，磷酸氢二钾1.0％，硫酸铵0.5％，聚乙二醇0.06％，硫酸亚铁0.01％，硫酸锰0.01％，硫酸镁0.01％，调整pH为6.8；所述无机陶瓷膜的膜孔径50nm；

将上层料液和滤液合并，用于提取L-色氨酸。

一种高效发酵生产l-色氨酸的方法

[0001]本发明涉及一种L-色氨酸的生产方法，具体说，是涉及一种以高产率制备高效发酵的L-氨基酸生产方法。

【背景技术】

[0002]L-色氨酸的生产方法先后经历了蛋白质水解法、化学合成法和微生物法三种方法，其中微生物法又包括直接发酵法、微生物转化法和酶法。随着基因组学和代谢组学研究的不断深入，人们将重组DNA技术应用在微生物育种和酶工业上，从而极大地推动了直接发酵法和酶法生产L-色氨酸的工业化进程。直接发酵法原材料简单、成本低、质量好、环保处理费用低，具有较大的优势。目前国内外的众多科研院所和企业纷纷利用这类技术提高L-色氨酸的发酵水平，完成了一系列基因工程菌的构建，大大提高了发酵单位。例如，日本协和发酵的Ikeda等人利用申请专利的基因工程重组菌生产L-色氨酸，专利号:US5447857。其菌种产能达到35.2g/L发酵液(2升罐小试)，放大后发酵单位达到66g/L。

[0003]目前，L-色氨酸发酵企业大多采用分批补料发酵方式。这种方式对发酵液中残留葡萄糖浓度控制和补入糖(包括葡萄糖和液糖)的分散程度要求较高。残留葡萄糖浓度若要控制的不当，就会影响到菌体的正常代谢，使菌体的代谢途径发生变化，严重影响L-色氨酸的发酵水平和产量，甚至会导致无L-色氨酸产生。补入糖的分散程度也会影响到L-色氨酸发酵水平，现有设备由于只使用单一的管道进料，就使得糖在发酵液中不能迅速均匀分布，造成局部浓度过高，引起此处菌体代谢异常，产生对菌体生成色氨酸不利的代谢产物，同时发酵液中得不到糖的菌体产生L-色氨酸能力受限。所以，残糖的控制水平和糖能否在发酵液中快速均匀分布对L-色氨酸的发酵水平起着至关重要的作用。

[0004]培养基中营养物质对菌体的生长和代谢产物的产生起着决定作用。现行L-色氨酸发酵培养基中各组分限制了 L-色氨酸产生菌株的生长和L-色氨酸发酵水平的进一步提闻。`

【发明内容】

[0005]本发明的目的在于克服现有生产工艺中发酵单位偏低、发酵周期较短、成本较高的问题，通过对发酵设备进行改造、发酵培养基配方与发酵工艺进行优化，从而发明了一种高效发酵生产L-色氨酸的方法。本发明在不增加任何额外设备和人力投入的情况下，延长了发酵周期，降低了劳动强度，大幅度的提高了发酵单位，降低了生产成本。

[0006]本发明的目的通过以下技术方案来实现:

[0007]一种高效发酵生产L-色氨酸的方法，包括种子培养和采用L-色氨酸发酵补糖装置将补入糖均匀分布并进行高效发酵培养的生产过程。

[0008]补入糖可以为口服葡萄糖，也可以为液糖，本发明中涉及的葡萄糖均可以用相同葡萄糖含量的液糖代替。

[0009]作为一种优选方案，所述的种子培养过程包括如下步骤:[0010]配制种子培养基，将菌种接入种子培养基中，接种量为0.1~5% v/v，在罐温20~40°C，pH6.5~7.5，溶解氧60%以上于500~2000L种子罐中培养至对数生长期的末期，600nm吸光度值10~30，制得种子液。

[0011]作为进一步优选方案，所述种子培养基配方为:葡萄糖2.0~5.0 %，磷酸氢二钠0.2~L 5%，蛋白胨0.1~L 0%，氯化镁0.1~L 0%，柠檬酸三钠0.10~0.50%，硫酸亚铁0.0001~0.001%，硫酸锰0.0001~0.001%,以上均为重量百分比，灭菌前NaOH调节pH值为6.5~7.5。

[0012]作为一种优选方案，所述的采用L-色氨酸发酵补糖装置将补入糖均匀分布以进行高效发酵培养生产过程包括如下步骤:

[0013]a)配制发酵培养基；

[0014]b)制得的种子液以1.0~20% v/v的接种量接种发酵罐进行发酵；

[0015]c)发酵过程中通过调节发酵罐的搅拌转速和空气流量将溶解氧控制在一定的水平上；

[0016]d)用氨水将pH自动控制在6.5~7.5 ;

[0017]e)流加葡萄糖含量60~70% w/v (重量体积百分比)的糖并采用糖分布组件,使补入的糖快速在发酵罐中分布均匀，并将残留葡萄糖控制在0.1% w/v(重量体积百分比)以下；

[0018]f)全部发酵进行到40~60h结束。

[0019]作为进一步优选方案，所述发酵过程中发酵罐培养温度为20~40°C，罐压0.02~0.06MPa,空气流量1: 0.5~1: L 5vvm，搅拌转速70~lOOrpm。

[0020]作为进一步优选方案，所述发酵过程中溶解氧控制方法为:在溶解氧回升前，通过调整搅拌转速和空气流量将溶氧控制在40%以上，溶解氧回升后按照固定的时间间隔提高搅拌转速(以10~12rpm的速率提高)或空气流量(最高提高到1: 1.5vvm)，同时提高补糖速率，发酵罐O~12h溶解氧控制在40%~60%之间，13h~结束培养溶解氧控制在30%~50%之间。

[0021]作为进一步优选方案，所述发酵过程中残留葡萄糖控制方法为:从发酵接种开始，每隔4h取样，采用葡萄糖测定仪对发酵罐发酵过程中发酵液中的残留葡萄糖进行测定，该测定仪使用具有高度专一性的葡萄糖氧化酶膜，根据测定结果确定合适的补糖速率，高于0.1%则降低补糖速率，低于0.1%则增加补糖速率，从而将发酵液中残留葡萄糖控制在0.1 % w/v 以下。

[0022]作为进一步优选方案，为实施本方法专门设计了一种L-色氨酸发酵补糖装置，主要包括发酵罐本体、糖输送主管道和至少一个糖分布组件，其中所述糖输送主管道位于发酵罐本体上方，从外向内穿入发酵罐本体内，其中所述糖分布组件活动连接在糖输送主管道的末端，贯穿所述发酵罐本体内部。

[0023]作为更进一步优选方案，所述糖分布组件主要由糖输送分管道和其末端做成环形的多孔分布管构成，所述糖输送分管道上端活动连接糖输送主管道的末端；所述多孔分布管管体上和末端设有出料孔，管体上出料孔呈不均匀分布，工作时糖会依次通过糖输送主管道，输送分管道，多孔分布管的出料孔进入发酵罐中，使糖在发酵罐中均匀分布。

[0024]作为进一步优选方案，所述多孔分布管上出料孔呈不均匀分布的方式为距离糖输送分管道越远，设置越密。

[0025]作为进一步优选方案，所述糖输送主管道与糖输送分管道的活动连接为卡环连接。

[0026]作为进一步优选方案，所述糖输送主管道上活动连接有蒸汽灭菌管道，蒸汽可以通过该管道直接进至糖输送主管道和分布组件。

[0027]作为进一步优选方案，发酵罐培养基配方为:葡萄糖0.5%~5.0%，磷酸氢二钠0.5 %~2.5 %，蛋白胨0.15 %~0.5 %，柠檬酸0.2 %~0.5 %，硫酸锰0.00045 %~0.0009%，硫酸亚铁0.002%~0.02%，灭菌前NaOH调节pH值为6.5~7.5。

[0028]作为进一步优选方案，所述发酵过程中补入糖包括葡萄糖和液糖。

[0029]与现有工艺相比，本发明具有如下优点:

[0030]1.本发明通过设计添加糖分布组件，使补入的糖能够快速均匀分布到发酵液中，有效的解决了糖局部浓度过高造成发酵液渗透压过大和产生“葡萄糖效应”的问题，使整个过程不至于产生葡萄糖抑制和过多的副产物乙酸；同时也解决了发酵液中局部葡萄糖浓度过低而底物限制，使发酵液中的残糖迅速耗尽，导致菌种生产能力不能得到最大限度发挥的问题。

[0031]2.本发明采用葡萄糖测定仪对发酵液中的残糖进行测定。该测定仪使用的是葡萄糖氧化酶膜，具有高度的专一性，提高了发酵液中残糖含量的准确性，更有利于发酵工艺的调整和控制。

[0032]3.在溶氧回升前，通过调整搅拌转速或者空气流量，将溶氧维持在较高的水平，溶解氧回升后按固定时间间隔调整搅拌转速或者空气流量，同时增加补糖速率，在发酵前期(O~12h)和发酵后期(13h~培养结束)将溶解氧控制在不同的水平，这一方面加快了菌种的生长速率，另一方面避免了工艺参数调整过快，糖补入量过多，造成发酵失控。

[0033]4.本发明与现有生产工艺相比不增加任何额外设备和人力投入的情况下，稳定了种子罐的生长周期，延长了发酵罐的发酵周期，延长20h左右，降低了劳动强度，大幅度的提高了发酵单位(4m3发酵罐:47g/L左右，36m3发酵罐36g/L左右)，降低了生产成本，整个工艺过程得到简化，十分适合于工业化生产。

【专利附图】

【附图说明】:

[0034]图1为本发明设计的L-色氨酸发酵补糖装置示意图，

[0035]图中数字和字母所表示的相应部件名称:

[0036]1.发酵罐，2.糖输送主管道，3.糖输送分管道，4.糖输送管道的蒸汽灭菌管道，

5.多孔分布管,6.出料孔,7.阀门,8.卡环(3.糖输送分管道和5.多孔分布管构成糖分布组件)

【具体实施方式】:

[0037]本发明实施例使用的工程菌为大肠杆菌菌株W3110trpEFBK，为利用市售菌株构建的L-色氨酸生产菌，构建方法详见CN201110400855专利。

[0038]本发明实施例中使用的化学及生物试剂均为分析纯或分析纯级别以上。

[0039]实施例1[0040]种子培养基:葡萄糖5.0%，磷酸氢二钠0.2 %，蛋白胨1.0 %，氯化镁0.1 %，柠檬酸三钠0.10%，硫酸亚铁0.001%，硫酸锰0.0001%，以上均为重量百分比，灭菌前NaOH调节pH值为6.5。[0041 ] 发酵培养基:葡萄糖5.0%，磷酸氢二钠0.5 %，蛋白胨0.5 %，柠檬酸0.2%，硫酸锰0.0009 %，硫酸亚铁0.02%，以上均为重量百分比，灭菌前用NaOH将pH调至6.5，灭菌后用高浓度氨水将PH调至6.5。[0042]将菌种接入种子培养基中，接种量为0.1% v/v，在

罐温33°C、pH6.5、罐压0.06MPa和溶解氧60%以上的条件下于1000L的种子罐中培养16~17h，600nm吸光度值10~30时，按1.0% v/v的接种量接入4m3的发酵罐中，采用如下工艺进行控制:罐温33°C，罐压0.06MPa，空气流量1: 0.5vvm,搅拌转速70rpm，在溶解氧回升前，调整搅拌转速，每次提高12rpm，并且提高空气流量，每次提高1: 0.25丽1，将溶氧控制在40%以上。溶解氧回升后按照固定时间间隔每次提闻12rpm的揽祥转速，最闻转速不超过180rpm,并且提闻空气流量，最高不超过1: 1.5vvm，同时提高补糖速率，将溶解氧控制在40%~60%之间。自动流加高浓度氨水将PH控制在6.5，通过流加葡萄糖含量为60~70%的糖，将残糖控制在0.1 %以下，发酵至42h结束。[0043]本实施例L-色氨酸的产量为29g/L。[0044]实施例2[0045]种子培养基:葡萄糖2.0%，磷酸氢二钠0.2 %，蛋白胨1.0 %，氯化镁0.1 %，柠檬酸三钠0.10%，硫酸亚铁0.001%，硫酸锰0.0001%，以上均为重量百分比，灭菌前NaOH调节pH值为7.5。[0046]发酵培养基:葡萄糖0.5 %，磷酸氢二钠0.5 %，蛋白胨0.5 %，柠檬酸0.5%，硫酸锰0.0009 %，硫酸亚铁0.02%，以上均为重量百分比，灭菌前用NaOH将pH调至7.5，灭菌后用高浓度氨水将PH调至7.5。

[0047]将菌种接入种子培养基中，接种量为5.0% v/v，在罐温38°C、pH6.5、罐压0.05MPa和溶解氧60%以上的条件下于1000L的种子罐中培养16~17h，600nm吸光度值10~30时，按15% v/v的接种量接入4m3的发酵罐中，采用如下工艺进行控制:罐温28°C，罐压0.05MPa，空气流量1: lvvm，搅拌转速70rpm，在溶解氧回升前，调整搅拌转速，每次提高12rpm，并且提高空气流量，每次提高1: 0.25vvm，将溶氧控制在40%以上。溶解氧回升后按照固定时间间隔每次提高12rpm的搅拌转速,最高转速不超过220rpm,并且提高空气流量，最高不超过1: 1.5vvm，同时提高补糖速率，将溶解氧控制在40%~60%之间。自动流加高浓度氨水将PH控制在7.5，通过流加葡萄糖含量为60~70%的糖，将残糖控制在0.1 %以下，发酵至42h结束。[0048]本实施例L-色氨酸的产量为30g/L。[0049]实施例3[0050]种子培养基:葡萄糖2.5 %，磷酸氢二钠1.5 %，蛋白胨0.5 %，氯化镁0.5%，柠檬酸三钠0.50%，硫酸亚铁0.0001%，硫酸锰0.001%，以上均为重量百分比，灭菌前NaOH调节pH值为6.8。[0051]发酵培养基:葡萄糖5.0%，磷酸氢二钠1.5%，蛋白胨0.15%，柠檬酸0.2%，硫酸锰0.00045 %，硫酸亚铁0.002 %，以上均为重量百分比，灭菌前用NaOH将pH调至6.8，灭菌后用高浓度氨水将pH调至6.8。

[0052]将菌种接入种子培养基中，接种量为3.0% v/v，在罐温30°C、pH6.8、罐压0.04MPa和溶解氧60%以上的条件下于1000L的种子罐中培养16~17h，600nm吸光度值10~30时，按15% v/v的接种量接入4m3的发酵罐中，采用如下工艺进行控制:罐温30°C，罐压

0.04MPa，空气流量1: lvvm，搅拌转速80rpm，在溶解氧回升前，调整搅拌转速溶解氧回升后按照固定时间间隔每次提高12rpm的搅拌转速,最高转速不超过220rpm,并且提高空气流量，最高不超过1: 1.5vvm，同时提高补糖速率，在O~12h时将溶解氧控制在40%~60%之间，在13h~培养结束将溶解氧控制在30%~50%之间，在发酵进行到40h时降低动力条件。自动流加高浓度氨水将PH控制在6.8，通过糖分布组件流加葡萄糖含量为60~70 %的糖，将残糖控制在0.1 %以下，发酵至60h结束发酵。

[0053]本实施例L-色氨酸的产量为47g/L。

[0054]实施例4

[0055]种子培养基:葡萄糖3.0%，磷酸氢二钠0.85%，蛋白胨0.1 %，氯化镁1.0%，柠檬酸三钠0.20%，硫酸亚铁0.0005%，硫酸锰0.0007%，以上均为重量百分比，灭菌前NaOH调节pH值为7.0。

[0056]发酵培养基:葡萄糖2.0%，磷酸氢二钠2.5 %，蛋白胨0.5 %，柠檬酸0.3%，硫酸锰0.0006 %，硫酸亚铁0.01%，以上均为重量百分比，灭菌前用NaOH将pH调至7.0，灭菌后用高浓度氨水将PH调至7.0。

[0057]将菌种接入种子培养基中，接种量为5.0% v/v，在罐温33°C、pH6.5、罐压0.03MPa和溶解氧60%以上的条件下于2000L的种子罐中培养16~17h，600nm吸光度值10~30时，按20% v/v的接种量接入36m3的发酵罐中，采用如下工艺进行控制:罐温37°C，罐压

`0.03MPa，空气流量1: lvvm，搅拌转速lOOrpm，在溶解氧回升前，通过调整搅拌转速(每次提高IOrpm)和空气流量(每次提高1: 0.15vvm)将溶氧控制在40~60%之间，溶解氧回升后按照固定时间间隔每次提高IOrpm的搅拌转速(最高150rpm)或空气流量(最高提高到1: 1.25vvm)，同时提高补糖速率，在O~12h时将溶解氧控制在40%~60%之间，在13h~培养结束将溶解氧控制在30%~50%之间，在发酵进行到40h时降低动力条件。自动流加高浓度氨水将PH控制在7.0，通过糖分布组件流加葡萄糖含量为60~70%的糖，将残糖控制在0.1 %以下，发酵至60h结束。

[0058]本实施例L-色氨酸的产量为36g/L。

[0059]上面对本发明实施方式进行了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。

【权利要求】

1.一种高效发酵生产L-色氨酸的方法，包括种子培养和采用L-色氨酸发酵补糖装置将补入糖均匀分布并进行高效发酵培养的生产过程。

2.根据权利要求1所述生产L-色氨酸的方法，其特征在于:所述的种子培养过程包括如下步骤:配制种子培养基，将菌种接入种子培养基中，接种量为0.1~5.0%，在罐温20~40°C，pH6.5~7.5，溶解氧60%以上于种子罐中培养至对数生长期的末期，600nm吸光度值10~30，制得种子液。

3.根据权利要求2所述生产L-色氨酸的方法，其特征在于所述种子培养基配方为:葡萄糖2.0~5.0%，磷酸氢二钠0.2~1.5%，蛋白胨0.1~1.0%，氯化镁0.1~1.0%，柠檬酸三钠0.10~0.50%，硫酸亚铁0.0001~0.001%，硫酸锰0.0001~0.001%，灭菌前NaOH调节pH值为6.5~7.5。

4.根据权利要求1所述生产L-色氨酸的方法，其特征在于，所述的采用L-色氨酸发酵补糖装置将补入糖均匀分布并进行高效发酵培养过程包括如下步骤: a)配制发酵培养基； b)将种子液以1.0~20% v/v的接种量接种发酵罐进行发酵； c)发酵过程中通过调节发酵罐的搅拌转速和空气流量将溶解氧控制在一定的水平范围； d)用氨水将pH自动控制在6.5~7.5 ; e)流加葡萄糖含量为60~70%w/v的糖并采用糖分布组件，使补入的糖快速在发酵液中分布均匀，并将残糖控制在0.1%以下； f)全部发酵进行到40~60h结束。

5.根据权利要求4所述的生产L-色氨酸的方法，其特征在于:所述发酵过程中发酵罐培养温度为20~40°C，罐压0.02~0.06MPa,空气流量1: 0.5~1: 1.5vvm,搅拌转速70 ~lOOrpm。

6.根据根据权利要求4所述的生产L-色氨酸的方法，其特征在于:所述发酵过程中溶解氧控制方法为:在溶解氧回升前，通过调整搅拌转速和空气流量将溶氧控制在40%以上；溶解氧回升后按照固定的时间间隔以10~12rpm的速率提高搅拌转速，或者提高空气流量，但最高不超过1: 1.5vvm，同时提高补糖速率，从而使发酵罐O~12h溶解氧控制在40%~60%之间，13h~结束培养溶解氧控制在30%~50%之间。

7.根据权利要求4所述的生产L-色氨酸的方法，其特征在于所述残糖控制方法为:从发酵接种开始，每隔4h取样，采用葡萄糖测定仪对发酵罐发酵过程中发酵液中的残留葡萄糖进行测定，根据测定结果确定合适的补糖速率，高于0.1 %则降低补糖速率，低于0.1%则增加补糖速率从而将发酵液中残留葡萄糖控制在0.1% w/v以下。

8.为实施权利要求4所述生产L-色氨酸的方法而专门设计的一种L-色氨酸发酵补糖装置，主要包括发酵罐本体、糖输送主管道和至少一个糖分布组件，其中所述糖输送主管道位于发酵罐本体上方，从外向内穿入发酵罐本体内；所述糖分布组件活动连接在糖输送主管道的末端，贯穿所述发酵罐本体内部；所述糖分布组件主要由输送分管道和其末端做成环形的多孔分布管构成；所述输送分管道上端活动连接糖输送主管道的末端；所述多孔分布管管体上和末端均设有出料孔，管体上出料孔呈不均匀分布，工作时糖会依次通过糖输送主管道，输送分管道，多孔分

布管的出料孔进入发酵罐中，使糖在发酵罐中均匀分布

9.根据权利要求8所述的L-色氨酸发酵补糖装置，其特征在于:所述多孔分布管上的出料孔的不均匀分布方式为距离糖输送分管道越远，设置越密。

10.根据权利要求4所述的生产L-色氨酸的方法，其特征在于发酵罐培养基配方为:葡萄糖0.5%~5.0%，磷酸氢二钠0.5%~2.5%，蛋白胨0.15%~0.5%，柠檬酸0.2%~0.5%,硫酸锰0.00045%~0.0009%，硫酸亚铁0.002%~0.02%，灭菌前NaOH调节pH值为 6.5 ~7.5。

11.根据权利要求1所述的一种高效发酵生产L-色氨酸的方法，其特征在于:所述补入糖包括葡 萄 糖和液糖。

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