液相色谱的时间最佳化
抖化学 / 2022-09-22
液相色谱的时间最佳化方程( 1-27 )略去了一个与分析者有关的重要参数:实现分离所需的时间。
已知高的k'值将延长分离时间，并可能使检测发生困难。前已指出，t,m=L/u; L=NH;及tR=tm(1+k')。综合这些方程可得
NH(1+k')
tR=----------------
U
或
UtR
N=--------------
H(1+k')
将此值代入方程( 1-27 )，并重排以求得分析时间(最后一个峰流出) tR的表达式
a (1+k')³ H
tR=16R²（------）²▪---------- ▪-------
a-1 k'² U
即分析时间tR是所要求的分辨率和以选择性、容量、柱效率以及流动相速度表示的柱操作条件的函数。
这一方程式预示，当其它一切变数保持恒定时，分辨率加倍则分析时间需增至四倍，即柱长增至四倍。此外，方程表明流动相速度增大一倍，分析时间应减为半(这不是严格正确的;因为H将增大)。同样，塔板高度减小一倍将具有同等的影响。a尤其重要;它从1.05增大到1.10,分析时间减少约四倍。
关于k’，已知大的k’值导致长的分析时间。因此，如果假设变化k’而不影响别的参数，方程( 1-29 )对k’进行微分应得到最小tR的K'值。这样就得到
k'³-3k'-2
dt/dk'==C(-----------------)
k'³
式中C包括全部其它变数，当
k'3-3k'-2
----------------=0
k'3
时，也即当k'=2,或tR=3tm时 (据方程1-13)，dt/dk'=0。
tR/C对k'作图示于图1-6;可看到当k'在1和5之间变化，同时假若k'不影响其它变数时，分析时间的增加是很小的。还有，单位时间的最大分辨率将在k'=2处。
方程(1-29)还指出，在给定的分析中，Rs与(H/U)½成比例，即由于H随U变化(上文已提到)，所以H和U必须-起考虑。
k'的改性.梯度洗脱
如前所述，当值很大时，对分析时间有不良影响;如果一个混合物的各组分呈现宽阔而稀释的流出峰，将引起检测的困难。等强度展开(流动相组成不变)的问题之一-是多 组分混合物的色谱图上(图1-7a )各组分之间显示不均匀的分离度。即在色谱图的前段出现一系列密集的峰，分辨不好;在中部，分离得好，在后部，分离好，但为宽的弥散峰，再继续进行下去将难以检测。Snyderins 称这种现象为“ 洗脱色谱的普遍问题”;这一行为对各种色谱形式都是共同的，它是由混合物中不同组分k'值的巨大差别所引起。前部的组分说明了低k'值的特征，中间部分是在最适的范围，k'≈2~5, 而后部的k'> 5。
这一问题的简单解决办法是，在分离过程中改变谱带的迁移速率。有时这被称之谓“k'”’的程序控制”，可有许多方法达到这一目标:温度程序;流量程序;联用柱(可为相同类型或不同类型);分阶洗脱;梯度洗脱。所有这些技术在液相色谱中都有其地位，至于选择何种技术，取决于几个因素:分离的难度;进行分离的频繁程度;是否易于回复到初始条件。
各种方法的有效性也值得注意;如果分离困难而且只需进行一次，则可以使用任何一种技术来达到所需的结果。温度程序和流量程序控制并不十分有效，因为它们对k值影响很小或完全无作用，尽管如此，仍能解决许多问题;其中流量程序虽然对k'完全无效，但因其易于恢复初始的条件而优于温度程序。温度程序可能需要较长的再平衡时间。
.jpg "标准样的模式分离")
在需做例行分析，即时间因素很重要时，联用柱技术“8特别有利。此时，将样品置于短的前置柱，移动快的组分被导人合适的(长的)分析柱;移动慢的组分经过转换阀导入一根较短的分析柱;并先完成在这个柱中的分析。然后，阀转向第一 根分析柱，分离移动快的组分。这种技术的个出色例子由Snyderi
提供，示于图1-7(C)。无可置疑，对于例行分析这是最可取的技术，因为它消除了在梯度洗脱中常见的较长的再平衡时间(见后)，而时间是应该用于设计好的分离条件上的。
如果样品包含一些快速移动的组分，随之又有一些移动缓慢的组分，就值得考虑分阶洗脱。在这种方法中，流动相组成经历急剧的变化，从而达到在合理的时间内完成全部分寓。然而必须注意，要保证“阶梯”不会带来顶林效应，即溶剂组成的改空引起两个或三个组分在
型化的馆剂前沿流出，在这种情况下极少或完全达不到分离。
使k'随着时间发生渐进变化的最有效的方式，无疑是梯度洗脱法。在此方法中，溶剂组成随时间而改变，使“洗脱液强度”以线性方式或者随着不同的曲率而整化，以产生所需的溶剂梯度。必须注意还不同厂商的仪器，他们声称可以产生任何形状的梯度;实际上这是按照程序混合溶剂，但并未描述所发生的“溶剂强度”变化，而后者在这一技术中是重要的因素。
有许多现成的溶剂体系可供利用，还可以定出更多的体系。第5章讲述了简单的二种或三种溶剂梯度的某些细节。R.P.W.Scott论述了(第12章)一个多溶剂梯度洗脱系列，在一个连续系列中包括了从已烷到水的整个溶剂范围。作为-种快速的“分类”方法，来对给定的分离问题估测大致的溶剂组成，这无疑是最好的方法。但它只限于使用移动丝检测器。所用的许多溶剂都有紫外吸收，因此紫外检测器不能用于这个系列。Rabel提出了第二个溶剂系列，它不包含吸收紫外光的溶剂，可用于快速确定大致的溶剂组成，然后，可再作精细调节以得到最佳分离(见第12章)。
这两种多溶剂梯度在HPLC中都有它们的地位，但是如有移动丝检测器可供使用时，则以Scott系列更好。使用这两种方法，以及凡是使用梯度洗脱时，都必须使柱子恢复到初始状态，最快大约也需要耗费梯度法本身所需时间的一半。
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