色谱分辨和速度的基本原理
抖化学 / 2022-09-22
色谱柱的设计
HPLC的核心是色谱柱。没有一根在高线性流速下运行时具有良好分辨力的柱子，则高压泵、专门设计的注射器、高灵敏检测器和梯度洗脱装置的全部优点就都失去了意义。因此，对HPLC使用者特别重要的是了解在实用情况下决定仪器性能的主要因素。
分辨和速度的基本原理
色谱过程的目的都是分离一个混合物的组分，方法是把混合物样品(最好是少量的)放置或注射在由分离材料(在LC中通常是细微颗粒)作成的色谱柱头上，然后，以泵输出的溶剂或洗脱液冲洗混合物通过柱子。在正确条件下，混合物的不同组分以不同的速度沿柱子迁移，并形成各别的谱带，这些谱带在迁移中互相分开。谱带在迁移中总要变宽，仅当谱带的展宽小于它们峰尖的距离时才能使组分分离成各别的谱带。运行正常的色谱，谱带是对称的(更专门地则称为高斯分布; 44页注1 )，下列关系适用于瞬间注射的两个紧邻的组分，它们沿柱子迁移的平均距离为Z(45页注2):
谱带的分离 ⊿z=z(⊿R/R)=z⊿k'/(1+k')
谱带的底宽 ω=(16H)½ ∠z
式中⊿R是两个谱带的Rt值之差，4k'是它们的柱容量比之差，H 是常数，称为“理论等板高度”，具有长度的量纲。如后所示，可把它当作柱内部的动态平衡的距离。
谱带的分辨率Rs定义为
⊿z
Rs=------
ω
综合方程(2-1)、(2-2)和( 2-3)可得
1 ⊿k' k' Z
Rs=---- --------- --------(-----)½
4 K， 1+k' H
比率( z/H )是长度为z的柱所相当的理论塔板数，这是以N表示的。k'的量值直接与溶质在流动相和固定相之间的平衡有关，因此与分配作用的标准自由能有关( 45页注2 )。
分配比的相对差值⊿k'/k'可用(a- 1)/(1+a)来表示，式中a=k'2/k'1。
因此分辨率可表示如下
1 a-1 k'
RS=------(-------)(--------)N½
4 1+a 1+k'
↑ ↑ ↖
(a)相对分配值因子 (b)保留值因子 (C)柱效因子
变动色谱参数N,k'和a对分辨本R,的影响
注:与方程(1-26)比较，两式的差别在于这一推导采用了下k'。
三个因子强调了三种定性的概念。( a )化合物的分离要求在两相之间具有不同的分配比(a≠1)。( b )要求分离的组分是被保留的(k'≠0)。( C )要达到分离就应具有一定的柱效。
对于给出恰好分离的峰(Rs=1.5 )的典型例子，需要的条件是N=3600，k'=2，a=1.15。 一次改变一种参数至N=1600, k'=0.8和a =1.10时对分辨率的影响示于图2-1。
分离速度
分离速度与冲洗速度密切相关，而后者又与柱的压力降及颗粒大小有关。LC柱两端的压力降⊿p可用方程表示
φηLu
⊿p=------------
d2p
式中φ是有量纲的参数，称作柱的阻抗因子;η是洗脱液粘度;L是柱长，u是流体线速度(即L/tm,其中tm是不保留溶质的通过时间); dp是颗粒直径。柱的阻抗φ决定于颗粒的类型及充填方式。其典型值列于表2-1。
柱的阻抗参数值表2-1
| |
干法充填 |
湿法充填 |
| 实心核球形颗粒(如薄壳材料) |
600~700 |
300~400 |
| 多孔微粒(碑片状)(如硅胶类) |
1000~2000 |
700~1500 |
| 多孔微粒(球形)(如硅胶类) |
800~1200 |
500~700 |
曾经常有争论，快速现代LC需要高压是因为采用了细小的颗粒。检验一下这种观点是有启发性的。假设有一长度为L的柱，颗粒直径为dp。如果其余条件相同，则可假设h与dp无关。
(如后文所示，这是较粗略的近似，h与u无关，虽然在现代常用的条件下并不完全如此。)因而塔板数相同而粒径不同的柱长可方便地表示为L=Nhdp
式中h对于不同的dp大体是相等的。如果希望用这些不同的柱子得到相同的分析时间，就必须使u与L成比例，因而也与d成比例。事实上u=L/tm=Nhdp/tm
于是柱子两端的压力降是
φη( Nhdp)2
⊿p=-----------------
tmd²p
=φηN²h²/tm
这样，洗脱时间tR=(1+k')tm峰的保留时间即
N²h²φη(1+k')
tn=------------------
⊿p
可见，对于一定的tm所要求的压力降与dp无关，但与N2和h'成比例。这一结论很重要，因为它指出了使用细的颗粒本身并不一定要采用高压，也并非必须产生高速。实际上，LC 中液体的粘
度比GC中气体的粘度大，是要求高压的理由。细颗粒在恒定的⊿p下需要高速度的理由是颇为微妙的，但如后文所示，起因是在实际操作条件下，通常颗粒越细而h就越小。方程也表明在给
定压力降和N而以分析速度来表示柱子性能的最好参量是h2φ。也即要获得最优性能要依靠同时减少流阻参数和换算塔板高度。因为现时的充填技术P难以改变两倍以上，所以重要的是考虑影响h的主要因素，尤其是如何在实践中选择适当操作条件以减小h。整个问题的中心是塔板高度受洗脱速度所决定的方式。
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