甲烷单加氧酶的谱学表征
化学先生 / 2019-07-30
MMOH 结构的谱学表征
一系列谱学研究表明，MMOH双核铁中心含有一个μ-氢氧桥(pr-hydr-oxo)结构，容易发生诱导变形，在反应循环过程中受其它组分影响，可以随外部环境的变化而改变。联合使用多种谱学手段对MMOH的结构变化进行表征，有助于阐明MMO的反应机理。根据文献报道，在结构化学中常用的各种现代光谱和波谱技术，都可以用来研究MMOH双铁核中心的构型变化。它们包括ESR (electron spin resonace, 顺磁共振)，Mossbauer, EXAFS(ex-tended X- ray absorption fine structural,外延X射线吸收精细结构)，ENDOR(electron nuclear double resonance,电子核双共振)，CD( circular dichroism，圆二色)，RR ( resonance raman,共振拉曼)等。使用多种谱学方法对MMOH结构进行表征发现，MMOH含有两个基本相同的双核铁中心。自旋哈密顿函数证明，MMOH在结构上与其它双核铁蛋白具有相似性。最重要的信息是Fe't态的自旋偶合要明显低于其它蛋白，这表明其双核铁的Fe配位状态可以发生较大的变化，包括配位数、配位几何构型、链的配位排列和簇极性环境等。MMOH中双核铁的氧化态(Fe3+-Fe+) 与外来分子的电子交换和偶合能力均较弱，MMOH的半还原态(Fe+-Fe2+) 可以为底物、产物、扣制剂和组分B提供与活性中心结合的机会，但只有在还原态(Fe2+-Fe2+)下，才可能完成催化氧化反应的循环过程。
甲烷单加氧酶的活性中心处于羟基化酶的a亚基上，在酶催化反应过程中，分子氧的一个O原子插人到烷烃的C H中，使烷烃羟基化，另一个O原子与2个质子结合生成水。因此MMO的结构表征，应重点研究羟基化酶双核铁中心的氧化还原状态，及其与催化功能和反应机理的关系。MMOH的双核铁中心是底物和分子氧活化的位点，EXAFS、EPR、Mossbauer 和X光单晶街射数据均证明，MMOH的每个原体有一个双核铁活性中心。
(1) MMOH结构的EXAFS谱学表征Prince[L17] 研究了Meth ylobacteri-ium sp. CRL-26菌MMOH的EAXFS谱，证明双核铁活性中心有一个μ氢氧桥(p-hydroxo) 或μ-氧桥(p-0xo)， 没有一S配基存在。每个铁有4~6个氧原子与之配位，铁原子与配基的平均距离为(1.92士0.03)X10 10m, FeFe的距离为(3. 05士0.05)X 10-10m,半还原态MMOH的EPR信号gvv =1.85，然而由于该样品的比活较低，在分离纯化中只得到了两个组分，缺少组分B,这就影响了表征数据的可靠性。Ericson[19]采用 EXAFS研究了Bath菌的半还原态羟基化酶，表明FeFe的距离为0.341nm,铁与其配基(Fe-0/N)平均间距为0. 205nm.这一结果后来被Dewitt11]的EXAFS实验所证实:Bath菌MMOH氧化态的Fe-Fe距离为0. 342nm,铁与配基(Fe-O/N) 的平均间距为0.204nm。
(2) MMOH结构的EPR研究Thomann[20]对 OB3b菌中MMOH的EPR研究表明，还原态、半还原态和氧化态的MMOH双核铁之间，均由y-OH桥连接。这很可能是还原态MMOH在氧化为氧化态时，保留了μ=-OH桥。采用低温Y辐照还原后的MMOH样品进行EPR研究表明，半还原态MMOH的g2v=1.83, FeFe的间距为0. 341~0. 343nm。铁与配基的平均间距从还原态时的0. 204nm,增加到0. 206 ~0.209nm,与铁配位的主要是O/N基。通过能量饱和EPR研究测得，反铁磁性交换偶合常数为J=一32cm-1.这些数据均表明，在半还原态MMOH活性中心有氢氧桥(hydroxo)、 烷氧桥(alkoxo)或羰基桥(earboxylato) 存在。综合以上谱学研究数据可以认为，Bath菌的MMOH活性中心结构与02输运蛋白PAP、Hr、RR2的活性中心相似。半还原态MMOH样品的ENDOR研究则表明，与铁配位的两个N来自于组氨酸配基，这两个N直接结合到Fe?t原子上，与Fe2+的结合相对较弱。
Derose采用顺磁谱研究了半还原态MMOH和小分子物质的相互作用(gv=1.82)发现，加人甲醇等小分子底物后，MMOH的EPR谱发生明显变化。在组分B存在下，羟基化酶EPR谱的g值发生位移，并显示出能量饱和性，这充分反映出组分B对活性中心结构的影响。从双核铁中心到MMOH表面的距离大约为1nm,组分B的存在可以改变天然酶活性中心的构型，对催化反应起调节作用。谱学表征结果补充了MMOH晶体结构的研究数据，因为在液体状态下，可以显示酶的不同组分间和酶分子与其它小分子之间的相互作用。为了表征自然状态下MMOH活性中心配位的灵活性，阐明反应机理，并为不同来源的MMOH或其它双核铁蛋白提供谱学分析数据，Derose 等通过多核顺磁技术(ENDOR, ESEEM),测定了活性中心未配对电子自旋的精确相互作用及核周围超精细结构的相互作用，提供了MMOH活性中心在反应中可能发生的电子交换和几何构型信息。
(3) MMOH结构的ENDOR谱学表征采用同位素 标记与ENDOR谱测定相结合的方法，研究小分子物质和酶活性中心的相互作用，是关联活性中心结构和反应机理关系的有效方法。在X频带ENDOR谱研究中，半还原态MMOH的共振信号能反映组氨酸中1'N与Fe2+的配位。用H标记的DMSO(二甲基亚砜)对MMOH进行处理发现，可用ENDOR谱跟踪DMSO和MMOH结合引起的Fe2+配位变化。有关ENDOR谱的一系列研究表明，甲醇等小分子是容易接近MMOH双核铁中心的，外来配基与MMOH的结合不是随意的，而是具有选择性。和MMOH结合的1.2H标记的DMSO对μ=-OH桥和水配基有影响，采用14.15N标记的组氨酸和MMOH结合则说明，外配基对2个组氨酸与MMOH活性中心配位虽然有干扰，但组氨酸和配位到Fe2+的水并没有被取代，也没有改变μ-OH桥;对1C、2H标记的DMSO与MMOH活性中心结合的样品进行ENDER谱研究表明，半还原态MMOH的Fe3+有一个外露的配位点，或称“易取代点”，在那里结合了DMSO.而Fe2+则表现得比较稳定，不存在“易取代点”，DMSO的结合位点可能是0原子而不是Fe。这一事实合理地解释了DMSO之所以能抑制甲烷氧化，是由于和水配位形成了第二个配位点。用H、9C标记的DMSO处理MMOH样品进行ENDOR谱研究，补充并扩展了Mossbauer 谱的研究结果。闹明了DM-SO是直接结合到Fe原子上，还是以非共价键结合在疏水腔中，从而间接地描绘了O2、CH等小分子底物和产物在活性中心上的作用位点4.23。用PF、2H标记的TFE (1,1.1-trifluoroethanol, 1.1.1-三氟乙醇) 和1.2H标记的乙醇处理氧化态、半还原态的MMOH,进行ENDOR谱研究证明，乙醇结合在半还原态MMOH的Fe2+和氧化态的羟基氧上。DMSO没有影响甲醇和乙醇，却替代了TEF在活性中心的结合位置。
从MMOH结构推测酶催化机理模型
综合MMOH的X射线单晶街射和EXAFS,EPR、ENDOR等谱学表征研究结果，半还原态的MMOH活性中心有四个潜在的底物和产物配位点，如图3-9所示。位置2是可交换的羟基氧离子，水可结合在位置1或位置3, DMSO可结合在位置4, ENDOR谱实验结果有力地支持了这一结论。后继实验又进一步揭示，活性中心结合了甲醇以后，EPR信号由g≠1.940,1.865, 1. 740变为1.963, 1. 862，1. 740。同时乙酸基也可以直接结合到活性中心上，从而证实了甲烷的产物时甲醇是直接配位到活性中心的位置1或位置3上，在这四个位置可以同时结合DMSO、甲醇、水，而不相互竞争。这表明可以根据谱学表征结果推测出MMOH的催化机理模型。
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谱学表征研究还发现，在y射线的照射下，氧化态MMOH可被单电子辐射还原为半还原态MMOH,并且其结构与化学还原的MMOH不同。这说明在化学还原过程中MMOH构型会发生变化，而辐射单电子还原不会改变MMOH的构型。Davydov 等首次报道了有关氧化态与半还原态MMOH可以相互转化而不影响其构型的直接证据。他们发现，在77K下，氧化态MMOH被Y射线单电子还原后，可转化为具有顺磁活性的半还原态MMOH,而基本保持了氧化态MMOH的构型，也就是说，EPR谱学技术可以作为MMOH从氧化态转化为半还原态结构的探针。为了研究组分B对MMOH的影响，Davydov等采用y射线辐射还原MMOH,使之成为半还原态的MMOH,然后进行EPR研究。结果表明，MMOB与小分子物质如DMSO、甲醇一样，也能使MMOH的双核铁活性中心发生构型变化。这一结果与氧化还原电势的研究结果致， 在甲醇、苯酚存在 下，MMOB对MMOH 有诱导变形作用。MMOB对MMOH的诱导变形是整个催化循环中的重要一步，它揭示了底物与酶的活性中心结合、转化及产物释放过程存在的位点。同样，亮氨酸通道的打开、质子转移反应、谷氨酸配基的羧基键位移等，也都和这种诱导变形作用有关。采用低温辐射还原MMOH的EPR研究，间接提供了氧化态MMOH与小分子作用的重要信息。在无其它组分时，DMSO、甲醇对EPR谱基本没有影响，而添加了MMOB之后有利于DMSO、甘油等小分子与活性中心结合，明显干扰了氧化态MMOH与DMSO、甲醇等小分子化合物的EPR信号。而MMOB对化学还原的MMOH与小分子结合及变构起抑制作用。这种细微的差别正是MMOB在催化反应中对MMOH的调节作用，也说明氧化态、半还原态、还原态的MMOH对小分子物质的反应活性是不同的。CD、MCD谱的研究也表明，MMOB、底物、抑制剂与活性中心的结合可以改变还原态MMOH的构型。同样OB3b的MMOH表征结果也是如此，活性中心的双核铁问由pu-OH连接，MMOH三个不同的氧化还原态是相对稳定的。Mossbauer、EPR谱显示，氧化态MMOH中含有两对相同的高自旋Fet,在半还原态时，EXAFS的研究进一步证明oxo桥被质子化，同样，来自OB3b的高活性MMOH的Mossbauer, EPR31]谱研究也显示，每分子中大约有两个氢氧(hydrooxo) 桥连接的双核铁簇。大多数谱学研究对还原态的MMOH更有兴趣，因为只有在还原态才能为分子氧提供电子使其发生裂解，将一个氧原子插入到底物中，而Fe本身变为氧化态，再从NADH得到电子，支持反应循环。Hendrich 等进行了MMOH的EPR研究，获得一个低场信号g=16;而当EPR信号有最大强度时，Mossbauer显示仅有一个高自旋的(S= 2)Fe2+,表明被观察的是一个完整的电子自旋系统。这与其它金属蛋白研究结果类似，如脱氧蚯蚓血红蛋白的叠氮化物，细胞色素C-P450氧化酶和一些模拟化合物。Fox 等 对来自OB3b的MMOH结构研究结果有所不同，他们通过EPR研究认为，氧化态的MMOH中铁没有直接与pμ-oxo桥相连，这与EXAFS的研究结果一致，在光谱中未发现pμ-oxo 桥的短Fe O键特征。值得一提的是氧化态的交换偶合强度(J= 15cm-1)比半还原态(J=60cm~1)弱，因为Fe3+与Fe8+的相互作用比Fe8+与Fe2+要强，说明MMOH在还原过程中有一个构型重排过程。在MeySO,或甲醇存在下，半还原态MMOH的EPR信号发生改变，主要是由于活性中心的配位变化所致，这与ENDOR分析结果是一致的。组分B的结合，减少了交换偶合，使:值移动减小，这是由于在组分B存在下，反应循环中产物的结合，使分子构型或双核铁间连接桥的化学性质发生了变化。Fox和Liu等的研究也证实，组分B的加人改变了MMOH的EPR谱，可以使MMOH的反应速率增加1000倍左右。
没有NADH提供电子，MMOH只能催化甲烧的单循环氧化反应。如果双核铁中心被非生物催化还原，或不采用分子氧而以H2O2作为氧源，其它两个组分(MMOB, MMOR)不存在，反应也可以进行，但反应动力学和其它催化性质会明显改变。MMOR和NADH能有效和活性中心结合并向MMOH提供电子，MMOB可以使MMOH结构发生诱导变形，把分子氧与双核铁中心的反应速率提高1000倍，都充分说明MMOB、MMOR在完成酶催化反应循环中起着不可替代的作用。对氧化态、半还原态MMOH进行CD、MCD研究和EPR结果一样，也都说明MMOB与MMOH的结合会引起双铁核中心构型变化; Pulver等进行的CD研究显示，底物为反-1,2-二氯乙烯、四氯乙烯，在MMOB存在下可诱导MMOH构型改变;而MCD研究表明，这种构型变化并未改变活性中心铁的配位状况。CD、MCD提供了一种对非血红素双核铁活性中心的直接检测方法。因为它可以探测Fe2+的de-d配基转换，并进一步观察配基的转化，而在近红外吸收光谱中，蛋白质、缓冲液的扰动信号是很弱的。可变温度、变场的MCD(VTVH-MCD)能用来评价基态、激发态二聚体亚基能级分裂和8n值。其结果可以用含亚铁离子的能级分裂，并结合配位键双铁核中心交换偶合的哈密顿函数来解释。还原态MMOH的CD、MCD研究则显示，MMOH含有2个被扭曲了的5配位Fe,呈现不同几何形状。VTVH-MCD研究显示，在基态有一个ge=14.7,需要2个铁磁性偶合(J-0.3~0. 5em-))的亚铁，每个铁的负零场分裂产生一个Sur = 4,M,=士4的基态。添加了小分子阴离子、酶的底物、产物、抑制剂后，CD光谱不改变。这说明这些小分子未直接结合到Fe原子或连接到铁活性中心上，而加入超过2倍量的MMOB后，CD和MCD光谱有明显变化。然而，VTVHMCD和自旋哈密顿函数并未明显改变，说明来自OB3b的MMOH活性中心比其它双核铁蛋白的亲电子性弱。根据CD、MCD谱的研究结果进行配位分析表明，MMOB只与2个Fet中的一个结合，并诱导其活性中心产生了几何构型的明显改变。也就是说被扰动的那个Fe2t,才有可能在催化分子氧的活化反应中起关键作用。
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