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甲烷单加氧酶的克隆与表达


化学先生 / 2019-07-29

        在1994年和1996年,美国Jahng和Wood发表了以OB3b菌为背景的基因工程菌降解三氯乙烯和氯仿的研究结果,当时由于构建的基因工程菌活性极低,所以他们认为该基因工程菌可能没有活性。2002 年,Wood在Microbiol. Comm.上又发表文章指出,1994年和1996年发表的那两篇论文,对基因工程菌活性的判断可能有误。他们认为,第一个以菌株OB3b为背景构建的Psudomonas Putida F1是有活性的,因为对TCE(三氯乙烯)的降解活性为5nmol/(min.mg)。而在1996年的报道中,由于他们使用的是休止细胞,对TCE的降解率虽然只为6~ 8μmol/(L.5h),但也有相应量的氯化物产生。第2个证据是MMO缺失型P. Putida F1,在甲苯不足的葡萄糖培养液中生长,不能表达甲苯双加氧酶,故P. Puida F1菌株也不能降解TCE,而含sMMO的基因工程菌P. Putida F1是能够降解TCE的。这就证明了sMMO的活性可以进行成功表达。1996 年的报道还表明,来自于OB3b的sMMO重组基因,在P. Putida F1、Agrobacterium tumefaoiens A114 和Rhizobium meliloti 102F34 三个不同宿主中表达,采用标准的MMO活性分析方法,测定它们的粗提取液对丙烯环氧化的活性,也得到类似结果。因此可以断言,在1994年和1996年的报道中,基因重组的sMMO虽然活性极低,但毕竟还是有活性,应该是可溶性甲烷单加氧酶基因的首次成功表达。


        在2003年日本京都大学理工研究所年报中,Fukuda 等报道了来自Meth-ylocystis sp. M菌株的羟基化酶基因高效表达结果。根据所报道的Methylo-cystis sp. M菌株的基因序列信息,PCR 扩增了羟基化酶的亚基,并将其克隆到PET质粒系统,表达在E.coli中。a、β亚基是以携带组氨酸标签的包涵体形式表达的,γ亚基是以溶解形式表达的,在E.coli 中超过50%的总蛋白为a、β亚基。 1999年,Lloyd报道了sMMO基因在M. tricbosporium 的sMMO缺失型菌株中表达,其活性为140nmol/(L. . min) (丙烯环氧化测定法),这一结果比野生菌活性提高了三倍。由此证明,在同源宿主中表达,其活性可比在异源宿主中表达高很多。

         目前,来自于OB3b的sMMO基因,在Meth ylomicrobium album BG8和Meth. ylocystisparvus OBBP这两个sMMO缺失型菌株中没有获得成功表达。但这两个宿主仍被认为是表达sMMO的最好宿主,因为它们的亲缘性很近,可能含有使蛋白质正确折叠的组装蛋白。通过含有相同启动子的宽宿主范围质粒,转人到该宿主细胞中,有可能得到高活性sMMO表达。使用sMMO缺失型OB3b的突变菌株可以同源表达sMMO基因,尽管突变菌株的获得非常困难,但还是解决MMO基因工程菌活性较低的方法之一。将卡那霉素标记插入到染色体的MMOX基因中,用来交换标记的突变菌株,已经可以用于产生突变的sMMO,该突变菌株表现出sMMO缺失。pMMO呈阳性显性,这个重组的质粒载体是PVR100Sc,它含有天然的启动子和sMMO操纵子,被成功构建后表现为sMMO阳性显性。在野生的OB3b中,Cu2+大于0.25pmol/L就抑制了sMMO的活性,而将重组质粒PVR100Sc转导人sMMO缺失型的OB3b宿主中,这个重组的基因工程菌表现子对Cu2+的不敏感性; Cu2+大于0.75pumol/L时,sMMO仍然可以稳定表达。在该条件下,添加过量的还原酶后,sMMO仅仅在无细胞提取液中才能被检测到,因为Cu2+在细胞外抑制了还原酶的活性。在高Cu2+浓度的基因工程菌中,sMMO能够稳定表达,可能是由于增加了携带在质粒PVR100Sc上的基因拷贝数,这也是唯一篇有关重组菌与野生菌具有相同活性的报道。在低Cu2+浓度时,重组菌的活性是野生菌的3倍,这就表明,有可能利用此系统进行sMMO的原位突变和构效关系研究。使用T7聚合酶表达系统,宿主为大肠杆菌,表达sMMO的组分B和还原酶,其表达产物是有活性的,而表达羟基化酶时活性极低,几乎没有活性。分析原因,有可能是在异型宿主中,没有酶的后期组装蛋白所引起的。
 

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