凝胶渗透色谱实验
抖化学 / 2022-11-05
柱的填充和评价
任何GPC仪器的心脏是柱组，因为分离就在这组柱内进行。GPC广泛使用于除聚合物以外的领域，而且可得到范围宽广的、不同类型的凝胶作为柱的填充物。然而，其中许多只能用于含水溶剂，另外一些则太软，不能经受GPC仪器的操作压力。实际上所有聚合物的GPC分析是在交联聚苯乙烯凝胶上或在多孔硅胶及多孔玻璃颗粒上完成的。随着紧凑的台式GPC色谱仪器使用的增长，情况正在迅速地变化着，大多数GPC仪器所有的标准色谱柱长为1.2米，外径7毫米，末端以放金属烧结片的配件封闭以保持凝胶填充物，终端为1/16英寸的不锈钢管，用于柱间的连接。按此方式，可使柱之间的死空间保持在最小限度。
CLPS凝胶可以干燥的或预填充柱的方式提供。CLPS凝胶的装柱方法已由Peakcer和Tweedale作了描述(42]:”将凝胶颗粒悬浮在密度匹配的溶剂混合液中，制成的淤浆在加压下泵人柱中。填充之后，柱子必须保持不含空气，因空气将破坏其性能。
很好地填充CLPS凝胶是一种技艺，多 数实验室会发现自已填充柱子的真实费用与市售的柱是相当的。CLPS柱用途很多，可在室温下使用各种各样的溶剂。一些溶剂不能使用，特别是醇、丙酮和二甲亚砜，因为它们能破坏凝胶;对于细孔径凝胶应避免使用二甲替甲酰胺，因为它可引起过度的泡胀。在升高温度下使用时，它们的寿命变化很大，报导的数字有从几周直到几年的。柱子因疏忽而注入空气，或由于样品的不恰当过滤而易被损坏，通常就不易恢复。尽管如此，CLPS 凝胶仍然在所有填充材料中使用最广泛，而且，前面概述的所有校正方法，都是由这种形式的填充物所发展的。
正常用于GPC的CLPS凝胶的粒径范围在30~ 75微米，常常具有宽的粒度分布。一般而论，较大的颗粒减低柱效，而较小的颗粒则引起不能接受的压降升高。标准的柱长是1.2米，但也可得到较短的柱用于台式的液相色谱仪。近年来，液相色谱仪已普
遍采用能操作于压力高达42兆牛顿/米" ( 6000磅/英寸)、无脉冲流动的精密泵体系。在非常高的压力下运转的可能性已导致新型CLPS柱填料的发展，基于降低凝胶粒度将减小聚合物分子的扩散程的观念，使能在更高的流速下达到接近于平衡的分离。
V ivileccia等曾描述过用于GPC的近于单分散的10微米直径CLPS凝胶的使用[31]。这些凝胶可从Waters Associates 得到预填充柱，商品名“μStyragel”。使用这--类型的柱可使GPC运行所需时间由2小时左右缩短到少于15分钟。这些柱子是很昂贵的，在本文写作期间，它们对于聚合物的分离性能除聚苯乙烯外，尚无充分报导。尽管如此，它们却提示了通向生产新的、快速、紧凑的GPC仪器的路子。
CLPS凝胶类比任何其它类型使用的更为广泛，但刚性无机凝胶颗粒却提供若干优点。无机凝胶类可以干填充，简单地将凝胶倾入柱中，连续振动以使凝胶床致密。这种凝胶因其刚性结构而不为溶剂所泡胀，并且不受高温操作的影响。柱子对偶然意外
注入空气的敏感程度很小，万一发生柱子堵塞，可以 取出填充物，清洗后重新填充而不丧失柱效。Titterton 曾用无机凝胶类在165*C连续操作，对聚烯烃类的分析得到极好的结果7。由于这些颗粒基本上是玻璃或硅胶，具有极性表面，对与聚合物的极
性相互作用是敏感的。使用这些材料分析极性聚合物时必须极为小心，特别当溶剂是非极性的，而分子量范围又低时更是如此。聚合物吸附于无机凝胶表面的问题，常可由对表面用硅烷化试剂如三甲基氯硅烷进行顶处理而减轻。无机凝胶的另外一个复杂情况是大多数GPC校正的研究是用CLPS完成的;虽然并无明确理由说明为什么CLPS的通用校正法对无机凝胶就不能成立，但却有象征提示，要小心从事!
填充10微米凝胶颗粒，在高压和高流速下操作的小口径柱的最新发展，并不限于CLPS凝胶。Telepchakl和Unger 等:48]曾描述了使用微米规模的多孔玻璃作为GPC基质。该微球用.种来说明的过程进行处理，在其表面载敷以烷基，这样显著地减
小了吸附效应。这些凝胶只能得到预填充柱，由Perkin-Elmer有限公司出售，商品名称“Vit-X"MacLean46描述了装有Vit-X柱的整机色谱仪和预先编制了测定分子量程序的专用计算机，适当的软件由Perkin Elmer公司出售作为他们PEP-2数据处理装置的附件。据称这-仪器可在不到20分钟的时间内完成对聚苯乙烯MWD的全部测定。然而，与多数用于GPC的液相色谓仪相同，本仪器不能在聚烯烃分析所需的高温下操作。
MacLean指出在最近提高聚合物GPC分析速度的工作中忽视了某些因素。特别须要注意， GPC 校正的对数形式表明在高速度操作时，分布曲线的高分子量端扫描速度极快，注意到这点很是重要。为了准确鉴别聚合物，必须极为精密地控制溶剂流速，快速记录数据的某些方式是必不可少的。对于聚合物的定量高速凝胶渗透色谱法，必须使用高级精密的恒流泵系统。
Baba和Satol473曾描述过在凝胶渗透色谱中使用0-氧化铝微晶的胶凝物。这种材料具有其它无机凝胶的全部优点，可给出极高的分辨率。就作者所知，0-氧化铝的 GPC填充物尚无商品出售。
无论采用什么样的柱子进行GPC分析，都希望有某些标准以评定其性能。本书前面各章已指出“分辨率”一词应用于色谱分离时的二元性质。原则上，在GPC实验中增大两个峰的分离有两个办法: (1)改善柱子或操作条件，以便减小扩散效应引起的峰在柱上加宽的量;(2)选择一个柱组，使两种化合物的洗脱相距更远。第-种方法相应于改善柱子的分离效率，第二种则意味着增大分离能力。-组GPC柱子的分离效率通常由借助于低分子量的标准物(常为三氯苯)测得的理论塔板数来表示。常规的CLPS凝胶柱通常提供约20塔板数/厘米，而山Styragel则能给出100塔板数/厘来。与之相反，正常的硅胶或玻璃柱给出典型的7塔板/厘米左右。
假若GPC仪器在低流速和小样品量操作时，柱的塔板数主要是衡量填充情况好坏，而不表示它在聚合物分析方面的性能。柱或柱组的分离能力由其校正曲线的斜率来确定，增大分离能力相应于较低的斜率。考虑到这点并需记住，因为样品在柱上停留
更长时间，峰的加宽将随保留体积的增加而增加，我们就可概括在装配-组用于聚合物GPC分析的柱子时所应该期望的因数。
(1)柱子应有最高的塔板数，这可由选择凝胶和填充方法来实现。
(2)校正曲线应有尽可能最低的斜率。
(3)为减少解释数据中的误差，校正曲线在样品的整个分子量范围内应是线性的。
(4)柱组的操作范围(即图10-3中V m和Vx +Vg之间的范围)应与样品将洗脱的范围相似。如果这一范围太窄，色谱图将发生畸变，并引起误差;如果太宽，分离效率将降低。柱组的选择显然将是这些代表理想情识的诸要求之间的一一个折衷。
操作变数
当一组凝胶柱装入色谱仪之后，还有两个重要的变数可由操作人员控制。即注射的样品浓度和通过柱子的溶剂流速。很多作者已对这二种变数进行了实验研究，并由Bly511以及Johnson和Porter[10]作了评述。
发现聚苯乙烯标准品的保留体积随着样品浓度而增大，这一效应对于高克分子量的标准物可以忽略不计，但对低克分子量的样品却较重要。此效应也影响到多分散样品，峰的最大值及后沿都对样品浓度敏感,但前沿则不受什么影响。这一效应反映在克分子量的平均值，在注射的样品量增大时它将显著降低。在适于获得合理色谱图的最低样品浓度下操作，可使保留体积对浓度的依赖程度减至最低;为使浓度效应减至最小，样品的浓度需要低于5毫克/毫升,校正曲线的制定则应使用可能的最稀溶液。浓度效应的修正不太常见;在必须的情况下，样品的表观克分子量可作为浓度的函数，并外推到零点浓度而测定。Boni, Sliemers 和Stickney[48]曾建议由外推到无限稀释的数据来建立校正曲线。
大多数GPC仪器装备了定量阀进样系统，它需要一定的时间使样品载荷于柱上，如所预期，缩短进样时间可增高分辨率。
研究溶剂流速对保留体积的影响时曾得出了矛盾的结果[10]。另外一个重要的因子是虹吸计数器在V n测定中的广泛应用。低流速时溶剂的挥发可引起误差，而在高流速下则过早地倾卸以及倾卸期间液体继续外流均能引起误差。这些观察指出，使
用虹吸计数器时需要小心，并暗示着点滴计数器更为可取。即使这一问题由仔细地设计虹吸器而消除之后，仍然可能有流速效应，但这些通常可由在低流速下操作而减至最小。然而，这也不能走向极端，因为在非常低的流速下，过度的谱带加宽会降低分辨率。一般说来，常规柱的流速在1.0毫升/分左右，微粒凝胶柱在4毫升/分，将使流速的效应减至最小。在极端情况下，可将校正和测试样品的数据均外推到零点注样量和零点流速。如果证明需要这样做时，改用另一种方法测定克分子量平均值也许更好。
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