流动相的选择
抖化学 / 2022-11-07
流动相的选择色谱分离中对流动相的选择，按理想应仅由所涉及的分离来决定。然而，检测器和柱本身对流动相的选择有所限制。通常，移动丝检测器所加的限制最少。只需所用的溶剂具有合理的挥发性。折光仪检测器在等强度展开法中不限制对流动相的选择，但如前所述，不能有效地用于梯度洗脱。UV 检测器不能用于具有明显的UV发色团的溶剂，甚至在UV区只有微小吸收的溶剂，在梯度洗脱时经常导致明显的基线阶梯。
采用UV检测器，大多数极性类似的混合物质的分离，可由使用仔细选定的溶剂混合液的等强度展开来完成。这类溶剂混合液的组成，主要是庚烷和氯仿，再加上1~5%V/V的一种或多种溶剂如乙酸乙酯，四氢呋喃，丙醇或甲醇。对未知样品寻找溶
剂的探索方法，已由Rabel作了描述「3]。
这一系统只利用对UV检测器是透明的溶剂。Rabel发展了一种适用于UV检测的逐渐增量的梯度系统，这种检测形式现正普遍使用。用较低灵敏度的UV调节位置(非线性的或X64)进行初始的检测工作，以消除由溶剂系统的改变所引起的基线漂移。更灵敏的调节可用作定量工作，因为选定的溶剂混合液，可能不再引起梯度或基线的这样陡的变化。选定的溶剂系列和溶剂混合液如下。
1.庚烷
2.庚烷含5%氯仿
3.庚烷含2%乙酸乙酯
4.庚烷含1%2-丙醇
5.庚烷含5% 2-丙醇
6.庚烷含10%2-丙醇
以上溶剂由手工操作，关掉泵及将管子转换到下一个溶剂瓶，按顺序使用。在转换中，注意避免空气泡进入系统。在完成初步的筛选之后，梯度的最终形式就易于调节了。当很多峰拥挤在一起时，梯度的斜率应予减小，这可由选择不同的溶剂，或延
长改变溶剂的时间，或增大混合室的体积来完成。何处出现了峰的分离距离过大，就需要相反的步骤。应用此步骤分离一个配制的农药样品的例子，示于图12- 2。选择流动相的另一个方法，是利用得自混合物薄层分离的资料。
如果已经由薄层色谱法完成了分离，则相似的溶剂对于硅胶柱大多是有效的。但因薄层板的展开包含有梯度洗脱的形式，所以，用于硅胶柱的溶剂极性，必需稍予减低。用于非极性键合相填充柱的溶剂，通常为甲醇和水或乙腈和水的混合液。溶剂组成的范围在含水5%到50%之间。准确的溶剂混合液，可由逐渐地提高水含量的实验来确定，直到实现所希望的分离。
为了最有效地使用吸附色谱法，必须具有包括全部极性范围从庚烷到水的一.系列溶剂。而且，为了最有效的梯度洗脱的展开，也必须采用系列中极性差别很小的许多溶剂，而不使用两种或三种极性差别很大的溶剂混合的方法进行分离。因为当流动相的组成由加入极性更强的溶剂而改变时，色谱展开的条件以两种方式发生改变。首先，吸附剂失活，导致溶质与固定相之间的保留分子力减低;其次，增大的溶剂极性导致溶质与流动相之间的洗脱分子力增大。两种作用均增大所有溶质的迁移速度，但吸附剂的失活是决定溶质的保留作用的最大因数。由此可见，如果溶剂的极性变化很大，就将有一个大的失活步骤，共极性处于原始的极性溶剂的极性与新的极性溶剂的极性之间的所有溶质，将从吸附剂上被顶替下来，一齐洗脱或分辨极 差。这种顶替效应已由Scott和Kucera做了一些详细的讨论[4]，得出的结论是吸附剂的失活必须控制，使以细小的步伐进行，以防止引起顶替效应而损害分辨率。这意味着在梯度洗脱中，从一种溶剂到另一种溶剂的极性变化，必须保持在很小的范围内。如前所述，为使一个梯度洗脱程序，对于含有任何种类的以及一。 切极性的物质的任何溶质混合物均有效，所采用的溶剂，必须包括从非极性溶剂庚烷到高度极性的溶剂水的全部极性范围。而且，如果溶剂间的极性变化保持很小，以减小顶替效应，则必须采用很多种溶剂，每种相继的溶剂比其前一种的极性稍大。Scott和 Kucera发现，可以采用12种仔细选出的溶剂，当用于渐增的梯度洗脱时它们有效地包括了庚烷和水之间的极性范围。他们在原始论文中给出了这些溶剂的详细情况以及选择它们的理由。然而，他们也发现，为了在那些中等极性的溶剂之间，提供所需的细小的极性增量，就不得不选择许多具有强烈UV发色团的溶剂。因此，他们的溶剂系
统不能使用UV检测器。作者们也得出结论，只用在光谱的UV区透明的溶剂，是不能包括庚烷和水之间的、以细小的极性增加的整个极性范围。但是，选择的所有溶剂都是挥发的。因此，该溶剂系列能使用移动丝检测器。实际上移动丝检测器是现时可
利用作多溶剂的渐增梯度洗脱的唯检测器。
为在色谱分析中利用溶剂系列，需要一种特殊形式的设备[5]。此设备必须 包括一个多重贮槽系统，-一个多 口选择阀门!和一个合适的程序装置。位于多口阀和泵之间的混合容器，必须具有这样的形式，使稀释体积如有需要便能在每次操作之间迅速改变，以获得必须的溶剂浓度分布。最后，柱和检测器的结构及操作，必须使柱外效应所导致的谱带扩展最小。此设备的方块图示于图12-3。在此不提供此设备的详细描述，因为原始论文中已有详细的描述，而且当前市场上可买到整套的设备。但溶剂程序器是新颖的形式，将简单地描述一下。
Anasol 20程序器是全电子化的定时仪器，它在一个集成线路存贮器中贮存有16个数，各有2位数字。一个20孔的旋转阀，对最初的16个位置自动控制-段精确的时间。此时间等于已经放置在贮存器中的相应数字。旋转阀的最后4个位置，用来在随后的样品分析之前，以适当的溶剂对色谱柱进行重新调整。这几个位置由安装在前方面板上的开关来定时。贮存器的内容，经过的时间和阀的位置都在一直显示着。可供应一个系列关闭阀门，这可在需要时自动或手动控制溶剂。Anasol20程序器也包含有用
作自动取样注射，事件标示和程序的再循环等备件。
对给定的柱子和流动相，采用等强度的展开法，由操作者选择的唯一变量是柱的流速，它调整从柱 子获得的效率和分析时间。在梯度洗脱展开的情况下，也需要选择所用溶剂的浓度轮廓，以提供最佳分离。如果使用渐增梯度洗脱法，每种溶剂的时
间间隔，必须与混合容器的适宜体积-起挑选。对于250和500毫米长，6.35毫米外径和4 .6毫米内径，填充了5或10微米硅胶的柱子，最佳操作条件已由Scott和Kucera所确定61。这些作者们考虑了两组最佳条件，组为 了提供最大的分辨率，另一组提供。最小的分析时间。这些条件是:
对于最大的分辨率:
Qt
------ =0.70
V
对于最小的分析时间:
Qt
------=0.85
V
式中Q是柱的流速，t是每个溶剂的时间间隔，V是混合容器的体积，此外，对于最大分辨率和最小分析时间二者都是Qt=2.5倍柱的死体积。
最后的条件确保每个溶剂用来展开色谱图都超过2.50的k'范围。
当采用250毫米长，4.6毫米内径，填充以10微米硅胶和具有3.0毫升死体积的柱子时，考察对于最小分析时间的梯度展开的条件。首先必须选 择流动相的流速，此值仅由所需的 效率所决定。假设选定的流速是1毫升/分，则Qt=2.5倍柱的死体积，1×t=2.5×3,或t=7.5分。 现因程序器有1分的识别时间，于是每种溶剂的间期t将是8分钟。因此
1×8
-------=0.85
V
或
8
V=----------=9.4毫升
0.85
因此混合容器的体积应调定为9.4毫升。
对于柱流速为2毫升/分时可计算如下
t=4分
t=9.4毫升 对于最小分析时间
以及
t=4分
V-11.4毫升
对于最大分辨率
渐增梯度洗脱法，超过其它梯度系统，优点在于操作条件只取决于所采用柱子的性质，而与所要分 离样品的性质无关。因此，当选定柱子之后，操作条件则可按以前描述的方式来确定。于是这些条件就是不变的，并适用于任何提交分离的样品。由此
可见，不管样品的复杂性，或其组成部分的极性范围，都能够立即得到分离。使用渐增梯度洗脱以分离这些多种多样的混合物，如蜂蜡、口红、组织中的类脂化合物以及保护肽类的例子，示于图12-4、12-5、 12-6和12-7。 可以看到，根据所用柱子的长度，在45分或90分钟内，可立即得到样品的色谱图，说明混合物的复杂性及其组分的极性范围。
通常，一个完全未知的混合物，首先应以梯度洗脱步骤进行观察，以获得样品组分的极性范围的确切指示。如果不这样做，存在的高度极性物质可能永远也不能被洗脱和检出。根据同样理由，如果可能，就应使用移动丝检测器，以使存在的所有物质均被指出，而不单只指出那些对UV光谱有吸收的物质。如果样品的性质已经确定，同时仅有一种或有限数目的溶质是感兴趣的(在控制分析中常为这种情况)，则等强度方法的展开是合适的。在这种情况下，极性低于欲测组分的物质可被迅速洗脱，不
经分辨地接近于死体积，而那些高极性的物质则可永久地保留在柱中。以这- .方式使用等强度展开，可实行快速的例行分析，但应注意，任何未洗脱的高极性物质均在柱上积累。必须使用高极性溶剂定期地除去这些物质，随后用一个合适的溶剂序列，使此柱再生，以达到相当于用作等强度展开的溶剂的活性[5]。
.jpg "溶剂号数时间")
.jpg "用作淅增梯度洗脱的设备的方块图")
.jpg "组织中类脂化合物的色谱图")
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