751型紫外分光光度法测定维生素B12含量
实验室k / 2019-07-19
一、目的
1.了解751型可见——紫外分光光度计的使用方法。
2.熟悉近紫外区波长的选择和测定含量的方法。
二、维生素B12的测定原理
维生素B12是含有钴的内络盐的有机化合物(C63H88O14N14PCo＝1355.38)，为深红色结晶或结晶性粉末，其注射液常为每1毫升含0.05mg、0.1mg、0.25mg、0.50mg和1.0mg维生素B12的安瓿剂型，在278±1nm、361±1nm与550±2nm波长处有最大吸收。前两个属紫外区，后者为可见光区的最大吸收波长，这三个λ最大都可用来测定本品。药典规定用λ最大＝361±1nm的波长处测定本品的吸收度A值，此波长下的比吸光系数E1cm·361 1%＝207。361nm属近紫外区波长，要用751分光光度计的紫外系统，其具体测定方法与有色物质测定方法相同。一般也应首先绘制吸收光谱曲线和测求λ最大，但本实验已规定在最大吸收波长λ最大＝361nm下直接对本品溶液进行测定，所以只要仪器已经校正，可在361nm波长处直接测定，不必再做吸收光谱曲线的绘制和λ最大的测定。
三、操作步骤
1.维生素B12样品比色液的制备 精密吸取B12注射液若干毫升(V)(要按注射液标示浓度而定)，加水准确稀释至几倍，即配制成每毫升含B12样品重为25～30微克的比色液。
如设V＝精取B12注射液样品的体积；V1＝稀释以后的体积；假如现有安瓿型B12注射液，其标示浓度为0.50(毫克/毫升)，所配成稀释后的比色液浓度为25(微克/毫升)，则
V×0.50(毫克/毫升)＝V1×25(微克/毫升)
因V1＞V，故n＝V1/V＝稀释倍数＝0.5×1000/25＝20(倍)
例如，精密吸取浓度为0.50(毫克/毫升)的B12注射液5.00毫升于100毫升容量瓶中，小心加蒸馏水至刻线，充分摇匀。其稀释倍数即为20倍。稀释后的浓度为0.50×5.00/100＝0.025(毫克/毫升)＝25(微克/毫升)，即C样＝25(μg/ml)。
2.在751分光光度计上测定吸收度A值
(1)检查仪器各部件、接线及电源电压等。
(2)备好空白液、样品液等比色液，选用石英比色杯。
(3)所有部件的开关都放在“关”或“O”位上。
(4)将暗电流调节器闸门(15)放在“关”的位置，即将光门拉杆推入，使光路遮断。
(5)灵敏度钮(22)先逆时针方向转到底后再顺时针转三圈左右。
(6)从仪器的光源灯室(7)、比色杯暗室(11)及光电管室(13)中取出干燥剂袋保存于干燥器内。
(7)将波长选择钮(16)旋至361±1nm处。
(8)将光电管拉杆(14)推入即为紫敏光电管处于光路承受端。
(9)狭缝宽度(20、19)调至0.05～0.10nm范围。
(10)将光源选择柄手(7的背部)板至氢灯位置，即凹面聚光镜处于氢灯的光路系统。
(11)开启附加的电子稳压器(220伏输入与输出)，再开启氢灯开关(4)(如无附加的电子稳压器则直接开启氢灯开关)，各指示灯亮后注视稳压器电表，调电压在220伏处，并开启放大器电源(1)(与钨灯同一个总开关)。如果开启氢灯开关后数秒钟内氢灯的蓝色指示灯不亮时，说明氢灯未亮，可再按下圆钮即可增高启动电压，当蓝色指示灯亮后说明氢灯已亮。
(12)选择钮(21)拨至“校正”挡如指针偏向一侧，立即调节“暗电流”钮，使指针约指“O”处，仪器预热20分钟。
(13)将空白比色液推入光路上.
(14)再节暗电流钮(23)使指零电表指针指“0”处。为使测定中操作准确，则须经常检查光路切断情况下电表指针指零。或每次测定时分别用暗电流钮校正指零。
(15)调节A、T读数盘(17)至T＝100％。
(16)选择开关钮(21)调到“×1”挡上。
(17)拉开光门(15)(即暗电流闸门)，光路接通，使单色光经空比色杯后射入光电管。
(18)调节狭缝调节钮使指零电表的指针大致指在零附近(相当于粗调节)，再调节灵敏度旋钮准确调至“零”位(相当于细调节)。此时不论推入还是拉出光门(暗电流闸门)，指零电表都应指零，否则应再如上重复调节。此时已相当于T＝100％。
(19)再将待测样品比色液推入光路。因其吸收度较空白液大，光电流减小，指针向右偏移。再轻轻转动吸收度A读数盘钮(17)使指零电表指针重新指“零”位，从读数盘上可直接读出待测样品液的吸收度A或T值来。如有其它被测液可按上述同样操作求出A或T值。
(20)实验中须按前述步骤严格操作。实验完毕后要关闭选择开关(21)、氢灯电源稳压器(4)和钨灯及放大器电源稳压器及附加交流电子管稳压器的开关。狭缝调节钮(20)转至0.01刻度处；波长选择钮(16)转至625nm处；A、T旋转(17)转至100％处；洗净比色杯放入盒中拔下电源插头；干燥剂袋放回原处；待仪器降温后用罩罩好；填写使用登记。整理好记录。
3.原维生素B12样品液百分含量及浓度计算
假设已知稀释样品液浓度C样＝25μg/ml＝0.0025％(g/ml)，测得A样＝0.50，则
则每1毫升原注射液中纯V·B12的毫克数＝每1毫升注射液的标示重×V·B12％。
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