薄层层析法的操作方法
实验室k / 2019-07-16
(一)铺板 薄层层析法是将吸附剂或担体均匀地涂铺在板上成为厚度一致的薄层，这个过程称为铺板或制板。制成以后的板称薄层板或薄板。要铺好薄板，首先对板的要求是平整、清洁。板一般选用普通玻璃即可。玻璃板的大小，根据操作需要而定。有6×20厘米，10×20厘米或正方形，也可用载玻片做微量薄层。玻璃板在使用前应先用洗涤液浸泡，再用自来水冲洗，最后用蒸馏水洗净后烘干备用。
常用的薄板有两种，一种是不加粘合剂的称软板；另一种加粘合剂的称硬板或称粘合薄层板。
不加粘合剂的铺板方法为干法铺板。加粘合剂的铺板方法为湿法铺板。现将两种铺板方法介绍如下：
1.干法铺板 将层析用的吸附剂撒在玻璃板的一端，另取一根比玻璃板宽度要长一些的玻璃棒、玻璃管或试管均可，在它的两端比板的宽度略窄一些处包上一条橡皮胶或套上塑料管、橡皮管，其厚度即为所铺薄层厚度。用于分离鉴定的薄层，其原度约为0.25毫米，用于分离制备用的薄层，其厚度最厚可达1毫米。接玻璃宽度在玻璃上再包几层橡皮胶做为涂铺时的固定边，以防止滑动使边缘不齐。然后从撒上吸附剂的一端，用力均匀向前推挤，推移时不宜太快，也不能中途停顿，否则铺出的薄层不均匀，影响层析效果。如图14-10。
干法铺板方法简单，但只适用于铺氧化铝和硅胶，其它如聚酰胺等就不易铺成。另外由于不加粘合剂，所以薄层很不坚固，易松动离散，展开时只能用近水平展开，显色时易吹散，因此在操作时应事常小心、细致。
2.湿法铺板 在吸附剂中加入粘合剂并用适当溶剂溶解粘合剂后与吸附剂调成糊状进行铺板这种操作称为湿法铺板，干燥后的板即成硬板。粘合剂种类很多，目前常用的粘合剂有煅石音(G)和羧甲基纤维素钠(CMC-Na)。用煅石膏制成的硬板，机械性能差，易脱落，但能耐受腐蚀性试剂如浓硫酸等的作用。而羧甲基纤维素钠制成的硬板，机械性能强，可用铅笔写字或标记，但不宜在强腐蚀性试剂存在下加热。
铺板方法
(1)倾注法 将按比例调制的糊状吸附剂倾注于玻璃板上，在较为水平的工作台上轻轻敲匀，使表面平坦光滑，放置在工作台上由空气干燥后活化。
(2)刮板法 可用二块3毫米厚的玻璃板中间夹一块2毫米的玻璃板(铺板用)，把已调好的糊状吸附剂倾注在中间的一块玻璃板上，再用一块边缘平整的玻片或塑料板，将吸附剂从一端刮向另一端，然后在空气中干燥后活化。也可用与干法铺板一样用一根玻棒，两端用橡皮管固定厚度，再用一根塑料管固定板的边缘，由一端推向另一端的铺板方法。图14-11。
现在市场上有涂铺器和已制成的硬板以商品出售，也可自制涂铺器，用涂铺器铺出的薄层厚度均匀一致。
(二)介绍几种硬板的制备
1.以煅石膏为粘合剂
(1)硅胶煅石膏(硅胶G)硬板 含煅石膏13％左右。称一定量的硅胶G，加水一倍至二倍，滴加几滴乙醇以防止气泡，在研钵中调成均匀的糊状(不能有结块)，立即铺板，时间太长易凝固。空气中干燥后于105℃活化半小时，置干燥器中备用。
(2)氧化铝煅石膏(氧化铝G)硬板 含煅石膏5％左右。称一定量市售氧化铝G，加一倍水，滴加几滴乙醇以防止产生气泡，在研钵中调成糊状，铺板，在空气中干燥后于150～160℃烘4小时，活化后置干燥器中备用。
2.以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为粘合剂
(1)硅胶CMC-Na硬板 称1克CMC-Na溶解于100毫升水中，加热煮沸，不断搅拌直到完全溶解。取180～200目层析用硅胶55克，加1％CMC-Na落液100毫升，调成均匀糊状、铺板，晾干后于110℃活化半小时，置干燥器中备用。
(2)氧化铝CMC-Na硬板 称取200目层析用氧化铝60～80克，加1％CMC-Na溶液100毫升，调成均匀糊状，铺板，晾干后于110℃活化半小时置干燥器中备用。
对已活化的硬板，应对光观察厚度均匀，表画光洁平整，没有粗粒、气泡和裂纹。
(三)吸附薄层层析中氧化铝和硅胶的活度测定法 取0.02毫升染料溶液(偶氮苯30毫克和对甲氧基偶氮苯、苏丹黄、苏丹红、对氨基偶氮苯各20毫克，溶于50毫升四氯化碳中)，滴加于氧化铝或硅胶薄层一端上，用四氯化碳展开后，比较其Rf值。活度定级表如下：
氧化铝、硅胶活度定级表
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Ⅱ |
Ⅱ |
Ⅲ |
Ⅲ |
Ⅳ |
Ⅳ |
Ⅴ |
Ⅴ |
| 染料 |
氧化铝 |
硅胶 |
氧化铝 |
硅胶 |
氧化铝 |
硅胶 |
氧化铝 |
硅胶 |
|
偶氮苯
对甲氧基氮苯
苏丹黄
苏丹红
对氨基偶氮苯
|
0.59
0.16
0.01
0.00
0.00
|
0.16
0.28
0.18
0.11
0.04
|
0.74
0.49
0.25
0.10
0.03
|
0.70
0.43
0.30
0.13
0.07
|
0.85
0.69
0.57
0.33
0.08
|
0.83
0.67
0.53
0.40
0.20
|
0.95
0.89
0.78
0.56
0.19
|
0.86
0.79
0.64
0.50
0.20
|
(四)点样 点样方法与纸层析法相同，原点直径不超过2～3毫米，为了避免在空气中吸湿而降低活性，一般点样时间不超过10分钟为宜，点样后待溶剂挥发，即可放入层析缸内展开。如用于分离制备，则应连续滴加样品溶液，使在原点成为一条样品线。应注意滴加样品的量要均匀，否则影响分离效果，待溶剂挥发后，置入层析缸内进行展开。
(五)展开 薄层层析的展开方式与纸层析基本相同，须在密闭容器内进行，并根据所用层析板的大小选用不同的层析缸，软板的展开只能用近水平方式展开(图14-12)。硬板可采用上行展开法、下行展开法、双向展开法等，一般采用上行展开法。
操作时先将容器密闭，待展开剂蒸气饱和，放进薄板，一般展开到薄板的为3/4左右，取出，在前沿做好标记，软板在空气中晾干，硬板可用电热吹风或烘箱中烘干。
在薄层层析中，当使用混合溶剂做展开剂展开时，有时会出现同一组分在薄层的中部比在薄层的边缘两边移动得慢的现象。即同一组分在薄板中部比两边的Rf值小。这种现象称为“边缘现象”或称“边缘效应”如图14-13所示。产生边缘效应的原因，是由于容器中展开剂蒸气没有达到饱和，因而在展开过程中，极性较弱与沸点较低的溶剂在薄层的两边较易挥发。使溶剂组成与薄层中部不同，结果使两边边缘处含极性较大的溶剂成份多。所以斑点的Rf值大，而中部斑点的Rf值小。消除边缘效应的办法，是要使层析缸内展开剂蒸气达到饱和，为此可以在缸的内壁贴上浸湿了展开剂的滤纸，以加速溶剂蒸气在缸内饱和速变。
(六)显色 展开结束后斑点检查方法也和纸层析相同，先在紫外灯下观察有无荧光斑点，如为硬板可用铅笔划出斑点位置并记录荧光颜色。软板可用小针划痕并做记录。如无荧光可选择合适的显色剂喷酒。软板喷酒显色剂时应趁展开剂尚未挥发呈潮湿状态即行喷酒，否则容易吹散。硬板则可待溶剂挥发后喷酒显色，有的可用具有强腐蚀性显色剂显色。有时可放在碘蒸气饱和的密闭容器中显色。
对于软板显色除用上述方法外，尚可采用。
1.压板法 薄层展开后取出，另取一块清洁、平整的玻璃板，上面涂显色剂，当薄板上的展开剂尚未完全挥发时，立即用涂有显色剂的玻片覆盖上，并压紧，即可显色。
2.侧吮法 薄层展开后取出，使展开剂完全挥发，再将薄板的另一侧(与展开方向垂直)轻轻浸入显色液中进行侧吮显色，当显色剂扩散到全部薄板后，取出干燥，即可出现色斑，但要注意被检组分不能被显色剂展开。否则不能使用此法显色。
(七)定性 薄层定性常将样品与标准品同在一张薄板上点样，展开，显色。如果样品组分的Rf值与标准品的Rf值相同，表示该组分与标准品为同一物质。也就是测Rst。因薄层的Rf值的影响因素很多，如吸附剂的粒度、展开剂的纯度、薄层的厚度、展开方式和展开距离、层析缸中展开剂的饱和程度、点样量等等。
(八)定量
1.目视定量法 是样品经层析后，直接观察斑点的大小，颜色深浅的定量方法，因此，此法要在同一块板上做样品和已知浓度的标准品系列，在相同条件下展开显色后，与已知浓度的标准色斑相比较，可近似地判断出样品中待测组分的含量。
2.洗脱定量法 取样品和标准品在起始线上点两个原点，且平行展开，显色时将样品用玻板遮掉，将标准品显色。然后在相当于标准品Rf值处，将样品从薄板上连同吸附剂一起刮下，置离心管中，选择适当溶剂将该组分从吸附剂中抽取出来。离心除去吸附剂，将溶液用其它仪器分析方法测定含量。
软板也可用捕集器吸取含有斑点的吸附剂(图14-14)然后进行提取定量。
3.薄层扫描仪定量 用一定波长，一定强度的光束照射到分离组分的色斑上，用仪器进行扫描，仪器用标准品校正后，即可测定色斑中组分的含量。
.jpg "干法铺板示意图")
.jpg "湿法铺极示意图")
.jpg "薄层层析图")
.jpg "薄层展开示意图")
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.jpg "软板样品收集及洗脱")
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