比色法和分光光度法定量分析
实验室k / 2019-07-15
朗伯-比尔定律是比色法和分光光度法定量分析的理论根据，被测溶液的吸收度与其浓度、厚度之间应符合A＝KCL的关系式。在符合光的吸收定律的条件下选用λ最大的入射光，对标准溶液和样品液在相同条件下测得它们的吸收度后即可算出被测组分的含量。
.jpg "朗伯-比尔定律是比色法和分光光度法定量分析的理论根据")
常用的定量方法如下：
1.标准曲线(工作曲线)法 配制含与被测组分相同的一系列标准溶液，在与被测组分有最大吸收波长光线下，测定各标准落液的A值，以A值为纵坐标，浓度为横坐标，绘制A-C曲线。将样品溶液在相同条件下测定A值，从横坐标上找出与此A值相对应的浓度，即为样品溶液的浓度。标准曲线的绘制应根据几次实验测得值的平均值进行绘制，这种方法对于大量样品分析或例行测定是比较方便的。在固定仪器和方法的条件下，绘制好标准曲线后可使用多次，不必每次实验都再进行绘制。但应注意，如果以后测定的条件有所改变，如仪器经动后灵敏度有所改变；所用试剂用尽又需重新配制；温度有较大变化等，此时需对标准曲线进行校正或重新绘制。
在实际工作中，测定标准系列的吸收度A值后做A-C曲线时，发现标准曲线只在一定浓度范围内呈直线关系。当浓度超过一定数值时，曲线顶端即发生向下弯曲的现象，如图13-21所示，说明该物质浓度超过某一数值时，其吸收度反而减弱，不再遵守比尔定律。可利用此浓度做为上限，重新调整标准系列的浓度并绘制标准曲线。但只要被测溶液浓度在曲线的直线范围内，也可直接进行定量测定。
根据测得的结果绘制A-C曲线时，可能发现有些坐标点不能连在一条直线上，如图13-22所示，这是由于加入标准溶液或试剂的体积不够准确等因素所造成的。此时可找出通过原点的靠近点最多的直线，并注意避免坐标点多偏向直线的一侧，还应对偏离直线较远的坐标点加以舍弃，最后做出较切合实际的工作曲线来。
2.对比法(比较法)
(1)与已知浓度的标准溶液比较 将标准溶液与样品液，在相同条件下显色(如用紫外分光光度计测定含有发色基团的物质则可不显色)，在最大吸收波长处分别测定吸收度A标和A样，因为
A标＝KC标L标 A样＝KC样L样
K为吸光系数，其值大小与被测物质本性和测定条件有关；L标和L样为两比色液的液层厚度，因使用相同规格的比色杯，故L标＝L样，则
A样/A标＝KC样L样/KC标L标＝C样/C标
∴ C样＝C标×A样/A标
根据样品测定的浓度C样和稀释倍数即可求出样品的含量。
当测定不纯样品中某纯品的百分含量时，也可将样品和标准品同时称取相同重量并溶解后配成准确而相同体积的溶液则C标＝C原样，在λ最大处分别测定其吸收度A，可直接计算出样品的百分含量。
如设C原样为不纯样品的总浓度 (其中纯被测组分能最大吸收单色光或紫外线)。则C标和C原样不论是样品或纯品，它们同体积的溶液中含溶质重量的浓度是相等的，即C标＝C原样，设C样是样品液中纯被测组分的浓度；C原样是样品液中纯被测组分和杂质的浓度。则原样品中纯被测组分的百分含量应当是
纯被测组分％＝C样/C原样×100％＝(C标×A样/A标)/C原样×100％＝A样/A标×100％
(2)和标准品的吸光系数相比较 此法是利用标准品和样品的比吸光系数或摩尔吸光系数之比代替吸收度之比，测定被测组分百分含量的方法。其优点是当没有标准品做对照时，则可从有关手册或资料中查出该物质在一定条件下的比吸光系数E1cm1%·λ或摩尔吸光系数ελ值。然后按照资料所规定的相同条件下把样品配制成与标准品相同准确浓度的溶液，平行测定它们的吸收度A值，再换算成E1cm1%·λ或ελ值。比较採准吸光系数和样品吸光系数，求得样品中被测组分的百分含量。
被测组分％＝A样/A标×100％＝[(E1cm1%·λ)样×C原样×L厘米]/[(E1cm1%·λ)标×C标×L厘米]×100％
因C标＝C原样，L＝1厘米，故
被测组分％＝(E1cm1%·λ)样/(E1cm1%·λ)标×100％
测定时，将样品和标准品配成相同浓度，可简化计算步骤。
.jpg "标准曲线弯头现象/A-C曲线的绘制")
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