钙在水溶液中以2价阳离子形式存在，其氢氧化物为强碱．许多含有羟基的有机试剂能与钙生成稳定的化合物，至今用于钙的比色分析的较好的显色剂是乙二醛－双[2－（羟基缩苯胺）]（GBHA），这是一种具有很高灵敏度和选择性的方法．此外，钙色素亦是钙的高选择性试剂：

       钙色素在pH2时与钙离子形成红色螯合物，在510毫微米处呈一最大吸收，此时的摩尔吸收系数为7．6×10³，且可在Sr²⁺和Ba²⁺占优势的样品中测定较少量的钙．

       GBHA法
       乙二醛－双[2－（羟基缩苯胺）]与Ca²⁺在碱性溶液中生成难溶络合物，反应为：

在1：1的水－甲醇溶液中上述络合物逐渐溶解，这是因为与钙离子相配位的两分子水被甲醇分子替代的结果．试剂在甲醇溶液中呈无色，倘加入氢氧化钠溶液则呈黄色，这可能是由于与羟基的离解作用的缘故．在实际工作中通常加入2毫升1N NaOH溶液（按最终体积为50毫升计算）而使溶液获得最适宜碱度，对NaOH而言约为0．04N，即此时试剂与钙离子的反应可进行完全，而此时试剂的颜色亦并不显著，它们的吸收曲线如图(Ⅷ-14)．

       这种红紫色络合物的最大吸收在516毫微米处，其摩尔吸收系数为1．8×10⁴．溶液经10分钟后方发色完全，以后便开始逐渐退色，半小时后约退去2－3％．除钙外由于试剂亦能与许多两价离子（如锶、钡）作用，此时可加入氰化物和硫化钠作为掩蔽剂，再加入小量的硫酸盐或碳酸盐防止锶和钡离子的干扰．镁及碱金属离子不干扰钙的测定，但碳酸盐、氟化物、草酸盐、酒石酸盐及EDTA等不允许存在．

       试剂和溶液：
       1．乙二醛－双[2－（邻羟基缩苯胺）]  0．05％甲醇溶液，称取50毫克试剂溶解在100毫升溶剂中即可．溶液可保存一星期；2．钙标准溶液  称取在110℃干燥恒重的CaCO₃固体2．4980克溶解在除尽CO₂的40毫升2N HCl中，移入1升容量瓶内，加水至刻度，此时浓度为每毫升含钙1毫克，制作标准曲线时根据需要稀释之；3．苛性钠溶液  1N及5N溶液；4．偶氮－氧化偶氮BN  0．01％溶液，称取该试剂10毫克溶解在100毫升四氯化碳中．使用前每10毫升该溶液中加1毫升磷酸三丁酯；5．四氯化碳；6．磷酸三丁酯．
       测定步骤：为了分离除去干扰离子，先在试液中加5N NaOH溶液至试液碱度约为0．5－1N（对NaOH而言），再用加有磷酸三丁酯的偶氮－氧化偶氮BN的四氯化碳溶液萃取振摇1分钟，这时钙进入有机相而干扰离子大都留在水相中．将有机相与水相分开后，在有机相中加入一定量的0．1N盐酸再萃取钙．此时的偶氮－氧化偶氮BN溶液保存起来下次又可再使用．

       取钙含量不超过50微克而无铵盐的分析试液一份（如有必要可加10毫克KCN和Na₂S作掩蔽剂），用氢氧化钠或盐酸中和至pH7－8，加20毫克硫酸钠，25毫升乙二醛－双[2－（邻羟基缩苯胺）] 溶液，2毫升1N氢氧化钠溶液，移入50毫升容量瓶中，加水至刻度，摇匀10分钟后在516毫微米（或用黄绿色滤光片）处测定消光度．用空白液为比较液．