吸附剂的标准化如前所述，吸附剂表面包含有各种强度的吸附部位。就硅胶而言，这些部位可从弱的部位(硅氧烷)到中等强度部位(游离能醇)直到强的部位(分子内氢键硅醇)不等。吸附剂的活性归四于这些部位中可用于色谱相互作用的相对有效数目。对于非极性流动相(如已烷)和非极性溶质(如多核芳烃)，因为吸附能最弱，所以高度活泼的表面比较合适。对于非极性流动相和极性溶质(如醇类)，则要求用减活的表面，因为吸附能强。
在活泼的吸附剂上,吸附剂与极性溶质的强烈相互作用引起长的保留时间和(或)峰的拖尾，极端情况下可能发生不可逆的吸附(例如羧酸类在活性氧化铝上)。色谱效率和线性容量➊都很低。为控制吸附剂的活性，可加入水分以选择性地覆盖或阻塞吸附剂表面活性最强的部位。吸附剂的含水量可以在装柱之前预先调节，但用高性能的LSC填充物时，通常是在装填好的柱中凭借流动相进行改性更为方便。对于非极性流动相，合适的含水量是非常重要的，但当流动相的极性增大时，含水量的重要性就减小了[13].
为了调节未装填吸附剂的含水量，可将填充物加热4~8小时以除去表面的残留水分。硅胶通常加热到125~150℃➊，氧化铝则需要200~400℃。使吸附剂在密闭的容器中冷却，然后加入已知量的水。经实验测定[13]， 硅胶每平方米表面积含水0.02~
0.04克时有最大的线性容量。此数量相当于单分子层的50~75%。对于多孔吸附剂如LiChrosorb TM,按重量比约占8~10%。对于多孔层微珠则要求较小的量，按重量比约为0.5~1.5%。水以液体状态加到密闭的容器中。旋转容器直到吸附剂湿块完全散开。最后将容器放置一-段时间(最好过夜)，使水分均匀分布在全部吸附剂中。将吸附剂标化，即可准备充填。标化后的吸附剂必须防止曝露于空气，因为它能与大气中的水分重新平衡。
吸附剂的含水量在使用过程中必须不发生变化。流动相中必须含有控制量的水分。如果流动相太“干燥”，则当流动相连续流过吸附剂时，后者中的水分将被带走。吸附剂的活性将变得更大，而溶质的ke'值将随着时间而增大。另一方面，如果 流动相太“潮湿”，多余的水分将吸附在填充物上，进一步使之失活。保留时间将降低，选择性也可能发生变化。只有当流动相与失活的吸附剂之间完全达到热力学平衡时，保留时间才能够重现。
使含水量最适化的方法虽然简单，但操作却很冗长费时。先注入ke'值约为1~5的标准溶质或测试样品，并测定其保留时间(或洗脱体积)。再进行第二次样品注射，如果 保留时间改变了，即是含水量没有平衡。第二次注射的保留体积较低时，说明溶剂太“潮湿”，假如保留体积较高，就是溶剂太“干燥”。这种实验易于由双泵式梯度型液相色谱仪来完成，因为干的溶剂可置于一个泵系统中，水饱和的溶剂则盛放在另一个泵中[4]。能够进行各种配比混合，并注射标准样品。当流动相的含水量有巨大变动时，需等待一些时间，因为平衡可能相当缓慢，对于非极性的溶剂例如已烷更是如此。研究表明[25\26]，对于这样的非极性流动相,当从50%水饱和溶剂改变到75%水饱和溶剂时，需要250~300倍于柱体积的溶剂。对于0%或100%饱和的二氯甲烷，共至必须使更大量的溶剂通过柱子[25a]。幸而任何一种已知饱和度的与水不互溶的溶剂，都可用来平衡吸附剂[13]。于是，一种水溶性高的平衡溶剂(如乙醚)可用来代替水溶性低的溶剂(如已烷)。
水饱和溶剂，尤共是非极性溶剂，需要特定的制备方法。因为溶解的速度非常慢，以及小水滴有时形成雾珠，所以不能只是与水一起搅拌。制备水流动相的办法是将溶剂滤过含水30%的30~60目硅胶柱。如果溶剂不发生反应，则将溶剂通过30~60日的干分子筛柱即可得到干的流动相。
由于制备水饱和溶剂的困难，一些工作者[4、25~29]宁愿用加人小量(0.1~0.5%)的醇类，例如加入异丙醇。这一极性改性剂与水的作用相同，但更易溶于非极性溶剂。在程序变溶剂的操作中，一次梯度洗脱结束之后，吸附剂必须再生(即恢复到其起始状态)。在洗脱的终点，较强的流动相与吸附剂处于平衡状态。为了恢复起始条件，必须由较弱的流动相来置换较强的流动相。有时，强流动相可引起吸附剂含水量的显著变化。再生的办法是: (1)使起始的流动相流过柱子，直到
获得起始的活性，或(2)按时间的函數减低流动相的强度(即. deº/dt )进行梯度回扫。由逆向的梯度进行逐步再平衡，已经证明比立即回到起始条件的办法更为快速[7\42]。图5-9所示为受L酚抗氧化剂的程序变溶剂分离的一种色谱图。
实用上的问题高度活泼的吸附剂可能导致不可逆的样品吸附或变化。硅胶是微酸性的，能强烈保留硷性化合物。有时，制备过程中残留的无机酸(见前面章节)可能引起对酸敏感的化合物发生反应。未经酸洗的氧化铝是碱性的，因此，对碱敏感的化合物不应在其上作色谱展开。经水失活的吸附剂可能会更“温和”。不可逆地吸附的化合物积累于柱的顶端，可能引起柱性能改变。解决的办法是使用吸附剂与分析柱相同的前置柱，并定期更换。在注射“脏”样品时，前置柱(或防护柱)也非常有用。
虽然薄层色谱( TLC )对于预测LSC的吸附剂、流动相及操作条件是很有用的，但某些薄层板上的粘合剂可能影响TLC的结果。当采用单一溶剂时常可直接从TLC推广应用到柱上;混合溶剂系统则有时出现困难。各溶剂对于干的吸附剂常有不同的亲和
性，因而在TLC板上发生分离。流动相的这种分离导致Rf值与柱的k’值稍有不同。此外，预先经流动相满温的柱子是以洗脱方式操作的，而TLC板则是以开放床方式运行，并且在样品组分离开板床之前分离就已中止。一种成功的从TLC外推到LSC的分离示于图5-10。注意，侗氮化合物的洗脱顺序是根据偶氦苯基本结构上取代官能团的相对极性。柱上的分离时间是5分钟，TLC的展开时间则为50分钟。注意，TLC不能分辨的硝基取代异构体(化合物4和5 )在柱色谱中可以完全分离。另外，HPLC可由
简单地测定峰面积(或峰高)而易于对各峰进行定量，若在TLC板上则须相当费时地测定斑点。
吸附剂通常极为稳定，可反复应用而不致变质。各批产品之间的不重复性也会成为问题。产品的一致性甚为重要，因为许多例行方法可能是用特定的固定相，花费了不少劳动研究出来的，所以有赖于商品吸附剂质量的长期稳定。早先，商品吸附剂在这方面曾经是名声极坏，但近来制造商已改进了他们的产品。即使如此，变化仍然存在，因此，贮存一批优质吸附剂的做法值得推荐。吸附剂特性的微小变动可由调节其含水量而得到补偿。
溶剂纯度在LSC中特别重要。前面已经详细讨论了溶剂含水量的影响。其它极性杂质可能影响柱的稳定性或洗脱体积。它们可能在柱顶积累而引起沾污，并改变柱的吸附特性。显然，含有紫外活性杂质的溶剂不宜用于吸收型检测器。即使是痕量杂质，
只要具有极性，就可能在柱顶端积累起来。如果溶剂强度增大，例如梯变洗脱时，它们可能在色谱图上形成无法解释的峰。有时，溶剂在使用前必须进行精制。虽然蒸馏可以去除高沸点化合物，但最好的精制方法是使溶剂通过大颗粒活性硅胶柱。同样也可在泵和进样器之间安装一个填充有活性硅胶的前置柱。
.jpg "抗氧化剂和氧化铝上的程序变溶器分离")
.jpg "从TLC按比例放大到高性能LSC")
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