制备规模的高效液相色谱
抖化学 / 2022-10-03
制备规模的高效液相色谱分析HPLC的目标，是使用很少的样品以最大的分辨率完成高速度的分离，而制备规模的HPLC的目标就极其不同。此刻，速度并不重要，所要求的是以最好的分辨率在单位时间内处理最大的样品量。需要考虑的主要效应是柱的过负荷问题。粗略地讲，当样品负荷约为每立方厘米填充物有1毫克溶质时，超载开始对分辨有重要的影响[1]。因此，大的制备容量要求使用大体积的柱子。例如1升的柱子应能分离1克物质而不丧失分辨率。在能够容许的严重超载情况下，还可以用更大的样品量。
在制备规模的LC中，显然应该利用无限直径效应。因为柱子必须有大的体积，所以要使用口径比较宽的管子，这样，极高的压力就可能有危险。限制压力在例如5兆牛顿/米²(50大气压)可能比较适当。为了避免从非常短粗的柱收集流出谱带的问题，可采用长度对直径的比率如20或更大些的柱。在这样的条件下，一根250毫升的柱可以是口径25毫米和长500毫米，而1000毫升的柱则可以是口径40毫米，长800毫米。
还需要决定用多大的颗粒直径，能够产生合理的速度和效串。表2-4表明，用5兆牛顿/米²(50大气压)压力降和20微米颗粒，就可能期望从650毫米的柱，洗脱时间略少于20分钟，对于k'=4的溶质得到5000左右的塔板数。这时洗脱液速度约为3毫米/秒，体积流速为每小时4升(25毫米柱)，或每小时10升(40毫米柱)。
在制备HPLC中，样品置于柱上的方式是最重要的。溶液尽可能地稀，但总体积不大于用来洗脱所要的峰的(洗脱液)体积的四分之一。这样，峰的展宽不会比使用很小样品所得到的流出峰大10%。如果注入小量的浓溶液，局部超载可能很严重，结果
引起分辨率的丧失。
在25%注射体积规则的基础上，对于5000塔板的柱，可注射的样品体积(k'=4时)对于两根柱(25和40毫米柱)分别为15和150毫升。几乎没有超载的样品量将各自为0.25克和1克，相应的初始溶质浓度低于2%。
注1高斯误差曲线
高斯误差曲线的一般形式
y=yoexp(-㏄²/2σ²)
如图2-12所示,σ称为标准偏差，就是在y=yo/∠e也既曲线拐点处的半峰宽度。峰的基底宽度以ω表示，由得，等于4倍标准偏差:ω=4σ限定ω的切线相交于高度y=2yo/∠e处，并包围一个面积4σyo/∠e =2.422yoσ高斯峰的面积是A=∠2π(yoσ)=2.508σyo
这一面积比三角形的面积大3.2%。
半峰高的宽度是
ω½=(81n2)
½σ=∠5.54σ=2.35σ
.jpg "图2-12高斯误差曲线的主要特征")
图2-12高斯误差曲线的主要特征
注2保留值参数
色谱中保留值的基本关系式
谱带速度
R-----------------------
洗脱液速度
流动相中的溶质量qm
=----------------------------------------------------------------------
流动相中的溶质量qm+固定相中溶质量qs
9m 1 1
=---------------=--------------------=---------
9m+qs 1+qs/qm 1+k’
R与纸色谱和薄层色谱中的Rι,值具有同样意义。k' 称作柱的容量比。在表现很好的色谱中，柱有效地在平衡状态运行，因此
K'=qs(eq)/qm(eq)=Cs(bq),Vs/Cm(eq)Vm
= K(Vs/Vm)
式中Cs(eg)，Cm(bq)是固定相和流动相中的平衡浓度，而Vs,Vm是固定相和流动相的体积; K是溶质在两相间的平衡分配比(有时以D表示)。k由下列方程与热力学参数相联系
⊿G=G0s-Gom=RTInK
=-RTInk'+RTIn(Vs/Vm)
⊿H=Hs-Hm=RT²dlnK/dT=RT²dInk'/dT
这样，从流动相到固定相的转移热(以及转移熵)可由通过在一个温度范围内测量K和K'而直接求得。
如第一个方程中表明的，R和K'有简单的关系：
R=1/(1+k')以及k'=(1-R)/R
如果两个溶质的R和k'值是R1和R2,以及K'1和K'2，假定溶剂移动了一段距离Z,则谱带的移动距离及其分离由下式给出
⊿z=z₂-Z₁=(R₂-R₁)zo
﹣z=1/2(z₁+z₂)=1/2(R₁+R₂)zo
因此
R=½(R₁+R₂)
另一方面，采用k'的表示法
1 1
⊿z=z₂-z₁={-----------=------------}z0
1+k'₂ 1+k'₁
k'₁-k'₂
=--------------------------z0
(1+k'₁)(1+k'₂)
⊿k'
=-----------------------z0
(1+k'₁)(1+k'₂)
1 1 z
z=½(z₁﹢z₂)={------------=-------------}-------
1+k'₂ 1+k'₁ z0
2+k'₁+k'₂ (1+k')z0
=-------------------------Z0=---------------------
(1+k'₁)(1+k'₂) (1+k'₁)(1+k'₂)
因此 ⊿z ⊿k'
----------=----------
z 1+k'
注3分配等温线及k'值
考虑一个吸附体系，其吸附等温线是每克吸附溶质对流体相(在色谱中为流动相)中溶质浓度作图。图2-13是一个典型的例子，其中ms=吸附剂(即固定相)的量。为了转换成色谱表示方式，注意弦的梯度是
9s/ms. qsVm
梯度=---------------=---------------=k'(Vm/ms)
Cm 9mms
这样k'=qs/qm的值与弦的梯度成比例，并是Cm的函数，只要吸附等温线是非线性的。对于一个典型的等温线，在低吸附量时，Cm增加时k'就降低，低浓度比高浓度的溶质更强烈地保留。色讲中的这个效应是产生拖尾峰，如图2 -3(a)所示，高浓度的
峰最大值先出来，后面有一个到低浓度的尾巴。
.jpg "典型的非线性吸附等温线及其与柱容量比k'的关系")
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