荧光寿命的实际测量
化学先生 / 2019-08-27
荧光是分子吸收能量后，其基态电子被徽发到单线徽发态后，由第徽发单线态同到基志时所发生的，丽黄光寿命是指分子在徽发单线态所平均停留的时间。费光物质的荧光寿命不仅写自的结构面且与其所处微环境的提性、黏度等条件有关，因此通过荧光寿命测定可以直接了解所研究体系发生的变化。费光现象多发生在纳秒级，这正好是分子运动所发生的时间尺度，因此利用交光技术可以“看”到许多复杂的分子间作用过程，例如超分子体系中分子同的聚集现象、固液界面上吸附志高分子的构象重排、蛋白质高级结构的变化等。
除了真接应用之外，黄光寿命测定还是其他时间分辨荧光技术的基础。例如基于荧光寿俞测定的荧光榨天技术可以研究辩灭剂与费光标记物或探针相互靠近的难易，从而对所研究体系中探针成标记物所处微环境的性质做出判断。基于荧光寿命测定的时间分辨荧光光谱，可以用来研究激发态发生的分子内或分子间作用，以及作用发生的快慢。另外，非辐射能量转移、时间分辨荧光各向异性等主要荧光技术都离不开荧光寿命测定。
荧光寿命测定的现代方法主要有三种，即时间相关单光子记数法(time correlated sin-gle photon counting. TCSPC)，相调制法(phase modulation methods)和频闪技术(strobetechniques)。早期人们也曾通过测定荧光物种在溶液中的荧光偏振(P)、溶液黏度(η)以及估算荧光物种的分子体积(Vo), 再根据Perrin方程来计算荧光寿命。
测量荧光衰减过程， 按定义可以设想一个激发脉冲，继而自然的衰减过程，如图3-13 所示。图中左边的矩形代表光激发脉冲，它引起了N个激发态发色团，产生初始为I的荧光强度:随后星指数形式衰减，在I/e 处的时间即τo值。如果用对数作图，从其斜率可算出平均寿命，
但是，仅用一次激发脉冲，然后测量整个衰减过程实际上是困难的，因为这样对检出系统有很高的要求和亚纳秒的响应时间，为克服这个困难，采用了多次激发样品的单光子计数法，测量荧光衰减过程及平均寿命。理论上已经证明，多次激发建立起来的衰减过程与一次激发引起的衰减过程结果是一样的。
单光子计数法的基础是把 上述过程变成观察一个光子、-个光子的发射过程，利用每一次激发，只观察从激发开始的时间到第一个发射出来的光子到达检出器的时间间隔，观察在不同时间，荧光光子出现的概率。例如，第一次激发，在10ns检出到光子:第二次激发，在20ns检出到光子:第三次激发，在100ns检出到光子:第四次激发，在40ns检出到光子等。只要激发次数足够多，统计结果就会得到如图3-14的指数曲线。曲线表示了不同时间荧光光子出现的情况，其中在20ns处最多。这就是荧光光子发射的概率分布。随着激发次数愈多，其统计结果与一次激发形成无数激发态， 随后发射所形成的荧光强度衰减过程息接近，直至相同。
得到的结果用计算机进行数据处理，用单指数或双指数拟合，得到τ。
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